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Jul 27, 2023

Combiné

Volume Communication Nature

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 4450 (2022) Citer cet article

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Les thérapies anticancéreuses ne présentent souvent que des effets à court terme. Les tumeurs développent généralement une résistance aux médicaments provoquant des rechutes qui pourraient être traitées avec des combinaisons de médicaments. L'identification de la bonne combinaison est difficile et bénéficierait d'écrans combinatoires à haut contenu et à haut débit directement sur les biopsies des patients. Cependant, de tels écrans nécessitent une grande quantité de matériel, normalement non disponible auprès des patients. Pour relever ces défis, nous présentons un flux de travail microfluidique évolutif, appelé Combi-Seq, pour cribler des centaines de combinaisons de médicaments dans des gouttelettes de la taille d'un picolitre en utilisant les modifications du transcriptome comme lecture des effets des médicaments. Nous concevons une approche combinatoire déterministe de codes à barres d'ADN pour coder les conditions de traitement, permettant la lecture basée sur l'expression génique des effets des médicaments de manière hautement multiplexée. Nous appliquons Combi-Seq pour cribler l'effet de 420 combinaisons de médicaments sur le transcriptome des cellules K562 en utilisant seulement ~ 250 gouttelettes unicellulaires par condition, pour prédire avec succès les paires de médicaments synergiques et antagonistes, ainsi que leurs activités de voie.

Malgré des progrès majeurs au cours des dernières décennies, le cancer demeure une cause majeure de décès. Notre meilleure compréhension moléculaire de la base moléculaire du cancer a conduit au développement de thérapies ciblées. Ces thérapies ont jusqu'à présent fourni une efficacité limitée et seulement dans un petit sous-ensemble de patients1, malgré des efforts importants pour caractériser génomiquement les patients afin de trouver des biomarqueurs de réponse.

Une approche qui promet d'améliorer cette situation consiste à compléter le profilage à grande échelle dans des conditions basales avec des mesures après avoir perturbé les cellules cancéreuses avec des médicaments2. Bien que de nombreuses approches puissent être utilisées pour effectuer des dépistages de médicaments, elles sont souvent de faible débit3, coûteuses en temps et en argent4 et/ou nécessitent de grandes quantités de cellules5, ce qui, ensemble, limite fortement le nombre de médicaments potentiels pouvant être criblés par biopsie tumorale. Cette limitation devient plus prononcée lors de l'examen des combinaisons de médicaments en raison du nombre considérable de combinaisons potentielles, qui augmente de façon exponentielle avec le nombre de médicaments testés.

En raison de capacités de dépistage limitées, des approches informatiques pour modéliser les interactions médicamenteuses ont été développées6. Alors que les modèles sur l'efficacité des médicaments se sont améliorés au cours des dernières années grâce à une augmentation des ressources de données disponibles, les prédictions sur les réponses aux médicaments restent difficiles et limitées à des systèmes bien caractérisés tels que les lignées cellulaires, limitant ainsi leur traduisibilité dans les cliniques. Parmi les différents types de données, les états d'expression génique des cellules se sont avérés hautement prédictifs de la réponse aux médicaments7. De plus, les référentiels de données sur les modifications transcriptionnelles induites par les médicaments, tels que LINCS8, se sont révélés être une ressource précieuse. Bien qu'il existe déjà des plates-formes de criblage de perturbations disponibles dans des plaques pour la transcriptomique en vrac9,10 et unicellulaire11,12, elles nécessitent généralement un grand nombre de cellules par condition testée, et elles n'ont pas été utilisées pour le criblage de combinaisons de médicaments. Par conséquent, l'intégration de lectures transcriptomiques dans une plate-forme miniaturisée de criblage de médicaments combinatoire avec le potentiel de cribler des biopsies tumorales permettra des prédictions plus pertinentes et augmentera notre compréhension du mode d'action des interactions médicament-médicament synergiques et antagonistes.

La microfluidique à base de gouttelettes, qui utilise des gouttelettes de la taille d'un picolitre à un nanolitre comme récipients de réaction pour réaliser des écrans cellulaires, offre une approche prometteuse pour atteindre cet objectif. En raison de la miniaturisation sur plusieurs ordres de grandeur par rapport aux écrans conventionnels à base de plaques, le nombre de médicaments ou de combinaisons de médicaments peut être massivement augmenté tout en travaillant avec un faible nombre de cellules d'entrée13. Nous avons précédemment démontré la première étape dans cette direction en intégrant des valves Braille dans un système microfluidique à gouttelettes pour générer des combinaisons de médicaments dans ce qu'on appelle des bouchons (~ 500 nl de grosses gouttelettes) stockés séquentiellement dans des tubes14. Des bouchons ont été utilisés pour cribler directement 56 options de traitement combinatoire sur des biopsies de tumeurs pancréatiques afin de trouver les paires de médicaments les plus puissantes à l'aide d'une lecture d'apoptose phénotypique. Alors que notre approche précédente fournissait la première preuve de concept dans le dépistage direct du matériel patient, les volumes encore relativement importants de 500 nl limitaient le nombre de paires de médicaments testées. En outre, un test d'apoptose ne fournit qu'une seule lecture du point final avec des informations limitées sur le mode d'action des paires de médicaments, ce qui pourrait améliorer considérablement notre compréhension et la prévisibilité des combinaisons de médicaments pour lutter contre les mécanismes de résistance.

Pour surmonter ces limitations, nous présentons ici une plateforme microfluidique qui permet d'effectuer des criblages hautement multiplexés de centaines de combinaisons de médicaments dans une émulsion de gouttelettes de la taille d'un picolitre. En introduisant une approche de codage à barres combinatoire déterministe, où des ensembles de deux codes à barres codent des paires de médicaments, nous avons réussi à dépister toutes les conditions de manière hautement multiplexée, sans avoir besoin de conserver un ordre spatial (par exemple, puits, séquence de bouchons). Étant donné que les codes-barres ADN ont été conçus pour l'analyse du transcriptome entier des cellules après une perturbation médicamenteuse, nous avons également pu effectuer un profilage basé sur l'expression génique massivement parallélisé des combinaisons de médicaments. Nous avons démontré que l'approche Combi-Seq présentée peut être appliquée pour déterminer l'impact des médicaments sur la viabilité cellulaire et la signalisation cellulaire, fournissant ainsi une approche à haut débit pour découvrir des paires de médicaments synergiques et déchiffrer leur mode d'action.

Des criblages de médicaments combinatoires multiplexés ont été réalisés dans des gouttelettes unicellulaires en encapsulant des médicaments avec des fragments de code-barres d'ADN (Fig. 1a). Chaque combinaison de médicaments par paires était codée par une combinaison unique de deux fragments de code-barres d'ADN, qui fournissaient ensemble un site d'amorçage pour la transcription inverse (poly-dT) et la PCR. Après incubation hors puce des gouttelettes, des réactifs pour la lyse cellulaire, la ligature des fragments de code-barres et la transcription inverse ont été ajoutés à chaque gouttelette par picoinjection15. La ligature de deux fragments de code-barres (BC-RT et BC-PCR) a donné des codes-barres fonctionnels, codant pour des combinaisons de médicaments par paires (Fig. 1). Étant donné que les codes à barres ont été utilisés pour la transcription inverse de l'ARNm libéré des cellules lysées, les transcriptomes ont été codés à barres en fonction des traitements médicamenteux (Fig. 1b). Par la suite, l'ADNc à code-barres a été extrait des gouttelettes pour construire une bibliothèque de séquençage (Fig. 1 supplémentaire). Enfin, un séquençage a été réalisé pour démultiplexer les conditions de traitement et analyser leurs effets sur l'expression des gènes.

a Vue d'ensemble du flux de travail Combi-Seq : (1) Les cellules ont été encapsulées avec des combinaisons de médicaments et des paires de fragments de code-barres codant pour des médicaments. (2) Après incubation hors puce, des gouttelettes ont été réinjectées dans une puce pour picoinjection afin d'ajouter des réactifs pour la ligature des codes à barres et la transcription inverse (RT), permettant le codage à barres du transcriptome en fonction du traitement médicamenteux. (3) Lors de la rupture des gouttelettes, des bibliothèques regroupées pour le séquençage ont été générées dans lesquelles les cellules du même groupe de traitement partagent le même code-barres. Cela a facilité le démultiplexage des traitements médicamenteux et les lectures basées sur l'expression génique pour des pools de 250 cellules. b Stratégie de codage à barres appliquée pour coder et décoder les combinaisons de médicaments pour les pools de cellules à faible apport. Des paires d'amorces PCR à code-barres (BC-PCR) et d'amorces poly-dT à code-barres (BC-RT) ont été jointes dans une réaction de ligature pour former des codes-barres fonctionnels, qui ont été utilisés pour la transcription inverse, codant ainsi une combinaison de deux médicaments. En brisant les gouttelettes, l'ADNc à code-barres peut être récupéré et amplifié pour le séquençage. c Pipeline microfluidique utilisé pour générer des combinaisons de médicaments en gouttelettes. (1) Des valves braille ont été utilisées pour générer des séquences de 20 bouchons de code-barres de médicament (BC-RT) dans le tube de retard. La tubulure de retard a été connectée à un générateur de gouttes (2) dans lequel des cellules et des mélanges médicaments-BC-PCR provenant de plaques multipuits ont été injectés. Enfin, en injectant les bouchons dans le drop-maker en ouvrant deux vannes d'huile, des gouttelettes contenant des paires de médicaments avec des codes à barres et des cellules ont été générées. M1–M3 indiquent les positions où les signaux de fluorescence ont été acquis. d Génération de bouchons à code-barres de médicament dans la tubulure de retard : (1) des bouchons espacés par l'huile ont été produits en ouvrant séquentiellement les vannes correspondantes, (2) résultant en une séquence de 20 bouchons à code-barres de médicament. (3) En ouvrant deux vannes d'huile, les bouchons du tube de retard ont été injectés dans la puce du fabricant de gouttelettes. e Production de gouttelettes à partir d'une suspension cellulaire, de bouchons médicament-code-barres et de mélanges médicament-code-barres injectés par l'échantillonneur automatique, entraînant la co-encapsulation de cellules avec des combinaisons médicament-code-barres. f Schéma illustrant la génération de combinaisons de médicaments à partir de 20 médicaments du module de valve avec des médicaments d'une plaque à 96 puits. Chaque séquence de 20 bouchons de code-barres de médicament (BC-RT) a été combinée avec des mélanges de code-barres de médicament (BC-PCR) d'un puits.

Afin de générer des combinaisons de médicaments dans des gouttelettes de la taille d'un picolitre, nous avons synchronisé le système de valve braille et l'injection de médicaments basée sur un échantillonneur automatique dans une puce à gouttelettes (Fig. 1c). De plus, des suspensions cellulaires ont été injectées dans la puce du fabricant de gouttelettes à une densité de 0,1 cellule par volume de gouttelette, pour obtenir des gouttelettes contenant des cellules individuelles (film supplémentaire 1). L'échantillonneur automatique (Dionex) a été chargé avec une plaque à 96 puits, chaque puits contenant un seul médicament avec le fragment d'amorce à code-barres correspondant (BC-PCR) et un colorant marqueur permettant de surveiller les étapes de mélange ultérieures. Les médicaments ont été consécutivement aspirés et injectés dans le fabricant de gouttelettes. La fenêtre de temps entre deux échantillons de l'échantillonneur automatique (~ 3 min) a été utilisée pour générer une séquence de 20 bouchons chimiquement distincts, chacun contenant des paires uniques de deux médicaments et deux fragments de code-barres (BC-RT et BC-PCR), en injectant des médicaments secondaires et des codes-barres (BC-RT) dans une puce de valve braille séparée (Fig. 1c et Fig. 2a supplémentaire). En particulier, chaque valve composée a été ouverte séquentiellement et de l'huile fluorée a été injectée entre les deux, de sorte que des bouchons de code-barres de médicament espacés par une phase huileuse non miscible puissent être injectés dans une tubulure de retard (Fig. 1d). Une fois que le tube de retard a été rempli d'une séquence de 20 bouchons, deux vannes d'huile ont été ouvertes pour injecter tous les bouchons dans le fabricant de gouttelettes (~ 2 min, Fig. 2b supplémentaire).

Ainsi, les bouchons de code-barres de médicament du système de valve ont été combinés avec les mélanges de code-barres de médicament injectés à partir de l'échantillonneur automatique et encapsulés avec des cellules individuelles dans des gouttelettes (Fig. 1e). En répétant ce processus, des centaines de combinaisons avec des paires spécifiques de fragments de code-barres ont été générées (Fig. 1f). Il est important de noter que l'augmentation du nombre de combinaisons peut être obtenue en augmentant le nombre de médicaments injectés à partir de l'échantillonneur automatique.

La synchronisation entre l'échantillonneur automatique et l'injection de médicaments à base de valve était cruciale pour s'assurer que les combinaisons n'étaient générées qu'une fois que le médicament injecté à partir de l'échantillonneur automatique avait atteint sa concentration de plateau. Entre chaque médicament provenant de l'échantillonneur automatique, une fenêtre temporelle avec des concentrations décroissantes et croissantes a été observée, comme le montre l'injection alternée de colorants fluorescents (Fig. 2a). Ce phénomène est basé sur la dispersion Taylor-Aris des solutés dans la phase porteuse continue et miscible (PBS) de l'échantillonneur automatique16. Une fois que la concentration du plateau a été atteinte, comme indiqué en mesurant une intensité constante d'un colorant marqueur fluorescent, les 20 bouchons composés ont été injectés dans le fabricant de gouttelettes et combinés avec le médicament de l'échantillonneur automatique et des cellules en gouttelettes. L'injection d'un tel train de bouchons a pris 2 minutes, ce qui a donné un temps total (production et injection de bouchons) de 15 secondes pour générer environ 2500 gouttelettes contenant des cellules et une condition de traitement combinatoire à code-barres. Une fois que les 20 bouchons ont été injectés, l'échantillonneur automatique a commencé à aspirer le médicament suivant.

a Injection alternée d'Alexa-488 ou de Cascade-Blue à partir d'une plaque de 96 puits à l'aide de l'échantillonneur automatique. Les échantillons injectés dans la fenêtre temporelle des signaux de fluorescence décroissants et croissants (boîte grise) ont été rejetés en s'assurant qu'aucune combinaison n'a été générée. Étant donné qu'aucun bouchon de code-barres de médicament de l'afficheur braille n'a été injecté pendant les fenêtres temporelles avec des concentrations instables (boîte grise), les gouttelettes ne contenaient que des codes-barres non fonctionnels (BC-PCR). Des fenêtres temporelles avec des signaux de fluorescence stables (boîte bleue) ont été utilisées pour générer des combinaisons de médicaments par la co-injection de 20 bouchons générés sur la puce d'affichage Braille résultant en des codes-barres fonctionnels. b Intensités de fluorescence d'une séquence de bouchons provenant des valves Braille complétées par Alexa-488 ou Cascade-Blue mesurées à la position M1 (= avant le mélange combinatoire). La superposition bleue reliant (a) et (b) illustre une série temporelle au cours de laquelle un cycle de 20 bouchons (deuxième bouchon sans colorant de référence) est combiné avec un échantillon de l'échantillonneur automatique. Des séquences alternées de médicaments complétées par Cascade-Blue ou Alexa-488 ont été utilisées pour quantifier la contamination croisée entre des bouchons fluorescents positifs spécifiques (par exemple, verts) dans l'échantillon négatif ultérieur (par exemple, bleu) pour les deux modes d'injection, séparément. c Contamination croisée des fiches vertes positives vers les fiches vertes négatives de l'afficheur braille (11 cycles comme indiqué en b). d Contaminations croisées des bouchons pour trois puces différentes : Le rapport entre les intensités de fluorescence d'un bouchon négatif bleu ou vert et du bouchon positif bleu ou vert précédent a été analysé pour quantifier le niveau de contamination croisée entre les échantillons séquentiels (n = 99, n = 80 et n = 171, respectivement). e Signaux de fluorescence de gouttelettes contenant des mélanges combinatoires. Nuage de points représentant les intensités de fluorescence mesurées pour les gouttelettes générées uniquement à partir de bouchons marqués Cascade-Blue et uniquement Alexa-488 injectés à partir de l'échantillonneur automatique, mesurés à la sortie des gouttelettes (n = 91 899). f Signaux de fluorescence des gouttelettes de (e) montrés pour 180 combinaisons individuelles. Les couleurs représentent des cycles de 20 bouchons de médicament combinés avec un médicament de l'échantillonneur automatique. Les boîtes à moustaches montrent la médiane et les premier et troisième quartiles sous forme de boîte, et les moustaches indiquent les points de données les plus extrêmes à moins de 1,5 longueur de la boîte. M1–M3 indiquent les positions comme indiqué sur la Fig. 1c. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Pour garantir le contenu des gouttelettes avec une contamination croisée marginale, nous avons conçu la géométrie et les connecteurs de tubulure de retard des puces de création de gouttes à valve braille de sorte qu'aucun mélange résiduel de médicament-code à barres ne reste dans les canaux (Fig. 3 supplémentaire). Avant chaque expérience, nous avons mesuré un proxy pour le niveau de contamination entre les bouchons de l'afficheur Braille. Cela a été fait en utilisant des médicaments complétés en alternance avec Alexa-488 ou Cascade-Blue, résultant en une séquence alternée de pics de fluorescence bleue et verte (Fig. 2b). Les intensités de fluorescence des bouchons ont été mesurées sur le fabricant de gouttelettes et les contaminations de médicaments / colorants d'un bouchon dans le bouchon suivant ont été détectées soit par des signaux verts dans les pics UV, soit par des signaux UV dans les pics verts (Fig. 2c).

Le rapport entre les signaux de fluorescence de chaque pic négatif (n) dans le canal vert ou UV avec le pic positif précédent (n-1) a été utilisé comme indicateur pour quantifier le niveau de contaminations croisées entre deux médicaments (Fig. 2d). Sur trois configurations de puces différentes (valve Braille et drop-maker), nous avons trouvé une moyenne de 1,5 % de contamination dans le canal UV et de 0,7 % dans le canal vert (tableau supplémentaire 1), indiquant que les systèmes décrits peuvent être appliqués pour générer des combinaisons avec une pureté suffisamment élevée.

Dans le pipeline microfluidique décrit, des combinaisons de médicaments ont été générées en mélangeant des médicaments injectés à partir d'un échantillonneur automatique et d'un module de valve Braille. Pour garantir des concentrations de médicament précises et exactes dans les gouttelettes, les deux médicaments devaient être encapsulés à un rapport constant et prédéfini. Nous avons validé le mélange précis de deux médicaments en complétant tous les composés sur l'écran braille avec Cascade-Blue et tous les composés de l'échantillonneur automatique avec Alexa-488. Nous avons observé une population principale très dense de gouttelettes doubles positives bleues et vertes, démontrant que les deux composés étaient co-encapsulés à un rapport constant (Fig. 2e). De plus, nous avons confirmé la co-encapsulation stable des deux colorants pour les gouttelettes sur des combinaisons individuelles (Fig. 2f). Les intensités médianes de fluorescence des combinaisons individuelles étaient très stables avec des coefficients de variation (CV) sur 180 combinaisons de 2,9 et 3 % pour les intensités bleues et vertes, respectivement. La dispersion des gouttelettes autour de la population principale peut s'expliquer par une phase d'équilibrage de flux courte (<100 ms) au début et à la fin des bouchons et la fluctuation de la trajectoire des gouttelettes dans un faisceau laser focalisé (Fig. 4 supplémentaire et Film supplémentaire 2). Par conséquent, nous avons conclu que les modes d'injection (valve Braille ou échantillonneur automatique) peuvent être synchronisés de manière robuste pour générer des combinaisons de médicaments en gouttelettes avec une précision et une pureté élevées.

Pour caractériser le pipeline microfluidique et démontrer son applicabilité pour effectuer des criblages de médicaments combinatoires basés sur l'expression génique, nous avons conçu un petit criblage de médicaments 4 × 4 (tableau 1). Tout d'abord, nous voulions évaluer si le mode d'injection des médicaments des valves Braille par rapport à l'échantillonneur automatique provoquait un biais, et avons donc chargé le même ensemble de médicaments sur les valves Braille et l'échantillonneur automatique. En cas de biais d'injection, nous nous attendrions à voir des différences entre la même combinaison générée dans l'ordre inverse (par exemple, Imatinib et Trametinib vs Trametinib et Imatinib). Deuxièmement, nous avons cherché à évaluer l'impact du mode de codage à barres sur la lecture de l'expression génique. À cette fin, nous avons d'abord codé les conditions de traitement telles que les médicaments injectés à partir des valves Braille étaient complétés par BC-RT à code-barres, tandis que les médicaments de l'échantillonneur automatique étaient complétés par BC-PCR. Ensuite, nous avons répété l'expérience avec des médicaments codant pour BC-RT à partir d'un échantillonneur automatique et des médicaments codant pour BC-PCR à partir des valves braille, en nous attendant à des résultats comparables si le mode de codage à barres n'a pas d'impact sur les lectures. Nous avons utilisé le pipeline décrit pour générer des gouttelettes, chacune contenant des cellules individuelles de leucémie humaine K562 et toutes les combinaisons par paires de médicaments et les codes-barres correspondants, et avons incubé l'émulsion pendant 12 h. Après ligation, les deux fragments d'amorce à code-barres ont formé un code-barres fonctionnel codant pour la combinaison de médicaments par paires. Afin d'obtenir trois répétitions, l'ensemble du processus a été effectué trois fois.

Chaque code-barres ligaturé a été utilisé pour inverser la transcription des transcriptomes des cellules perturbées (Fig. 1a). Après le prétraitement des données (Méthodes de prétraitement des données d'expression génique) et les contrôles de qualité initiaux (lecture médiane et nombre de gènes par échantillon de 3, 47 × 105 et 3229, respectivement, Fig. 5 supplémentaire), nous avons effectué une réduction de dimension à l'aide de l'incorporation de voisins stochastiques distribués en t (t-SNE, Fig. 3a) sur la matrice de comptage démultiplexée. Pour analyser si un biais systématique survient en fonction de la source d'injection (auto-échantillonneur ou vannes Braille), nous avons analysé les échantillons en fonction du médicament de l'échantillonneur automatique (Fig. 3a, panneau supérieur gauche), du médicament des vannes Braille (Fig. 3a, panneau supérieur droit), de la combinaison médicamenteuse "ordonnée" (où nous avons fait une distinction entre, par exemple, l'association Imatinib-Trametinib et Trametinib-Imatinib) et de la combinaison "non ordonnée" (où Imatinib-Trametinib et Trametinib- Les échantillons d'imatinib n'ont pas été distingués). Alors que le mode d'injection pour les médicaments uniques de l'échantillonneur automatique (Fig. 3a, panneau supérieur gauche) ou des valves Braille (Fig. 3a, panneau supérieur droit) n'a qu'un impact modéré sur le regroupement des points de données individuels, leurs combinaisons par paires (Fig. 3a, panneaux inférieurs) est le déterminant le plus fort de la cohésion et de la séparation entre les échantillons.

a Tracés TSNE de données d'expression génique normalisées. Les échantillons sont codés par couleur en fonction du médicament de l'échantillonneur automatique (panneau supérieur gauche), du médicament des valves braille (panneau supérieur droit), de la combinaison ordonnée (panneau inférieur gauche) et de la combinaison non ordonnée (panneau inférieur droit). Le code couleur est étiqueté pour les médicaments de l'échantillonneur automatique et des valves braille (panneaux supérieurs). b Scores de silhouette de regroupement d'échantillons basés sur des médicaments d'échantillonneur automatique/valves Braille et des combinaisons ordonnées/non ordonnées. Les scores des silhouettes sont comparés à des distributions aléatoires (code couleur) créées en permutant des étiquettes d'échantillon. c Carte thermique de l'activité des voies des échantillons. Les activités de la voie PROGENy ont été calculées pour chaque échantillon (z-scores des activités de la voie, code couleur) et la matrice d'activité de la voie a été regroupée de manière hiérarchique. Les médicaments des combinaisons sont codés par couleur (vert clair : médicament de l'échantillonneur automatique, bleu : médicament des valves braille, cyan : même médicament de l'échantillonneur automatique et des valves braille). d Modifications de l'activité des voies induites par le médicament. Un modèle linéaire (pathway_activity ~YM155 + Imatinib + Trametinib) a été ajusté pour chaque voie, et les coefficients du modèle linéaire (code couleur) pour chaque médicament sont tracés sous forme de carte thermique. e Modifications de l'activité MAPK induites par le médicament. Activité MAPK (axe y) regroupée en fonction du médicament de l'échantillonneur automatique (axe x) et du médicament des valves Braille (code couleur), n = 3 expériences biologiques indépendantes pour tous les échantillons, à l'exception de YM155_Imatinib et DMSO_Imatinib n = 2. Les boîtes à moustaches montrent la médiane et les premier et troisième quartiles sous forme de boîte, et les moustaches indiquent les points de données les plus extrêmes à moins de 1,5 longueur de la boîte. f Corrélation des activités de la voie MAPK entre deux écrans 4 × 4, réalisée avec des attributions de codes à barres permutées (r = 0,637, p = 0,01 et R2 = 0,406), la zone ombrée montre un intervalle de confiance à 95 % de l'estimation de la régression. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Pour quantifier davantage l'étendue du regroupement des échantillons en fonction de la source d'injection pour les combinaisons ordonnées et non ordonnées, nous avons effectué une analyse de silhouette (Fig. 3b et un contrôle de la qualité des données d'expression génique basé sur le regroupement des méthodes). Comme la distribution des scores de silhouette dépend du nombre de clusters (4 pour les médicaments, 16 pour les combinaisons non ordonnées et 10 pour les combinaisons ordonnées), nous avons comparé les scores de silhouette du clustering aux distributions aléatoires créées en permutant les étiquettes d'échantillon. Les scores de silhouette pour les médicaments uniques et les combinaisons étaient significativement plus élevés (valeurs p <0,01) que les distributions de fond, montrant que les échantillons se regroupent en fonction des médicaments et des combinaisons utilisés. Par conséquent, le mode de codage à barres pour les médicaments uniques injectés à partir des valves Braille ou de l'échantillonneur automatique codé avec des amorces RT ou PCR à code-barres n'introduit pas de biais, car leur impact sur le regroupement et donc l'expression des gènes est indiscernable. Contrairement à cela, les combinaisons par paires ont été motivées par le regroupement des échantillons, montrant que les deux médicaments ont été détectés ensemble de manière impartiale. Nous avons également effectué un regroupement hiérarchique en utilisant les 100 gènes les plus exprimés dans les échantillons, ce qui a également montré un regroupement basé sur les médicaments et les combinaisons des échantillons (Fig. 6 supplémentaire). De plus, les échantillons traités étaient généralement bien séparés des témoins DMSO dans une analyse en composantes principales (PCA, Fig. 7 supplémentaire). Pour démontrer davantage que notre pipeline expérimental n'introduit pas de biais techniques importants, nous avons effectué le petit écran 4 × 4 avec des codes à barres échangés (médicaments à valves braille complétés par BC-PCR et médicaments d'échantillonneur automatique complétés par BC-RT). Nous avons observé une qualité similaire (Fig. 8 supplémentaire) et un regroupement d'échantillons basés sur le tSNE et les 100 meilleurs gènes exprimés (Fig. 9a, b, 10 supplémentaires).

Pour analyser plus en détail les signatures d'expression génique des cellules traitées avec différentes combinaisons, nous avons calculé les changements d'activité de la voie pour chaque échantillon, en utilisant la méthode PROGENy17,18,19. PROGENy calcule les activités des voies à partir des données d'expression génique pour 14 voies liées au cancer. Le regroupement hiérarchique d'échantillons basé sur les activités de la voie (Fig. 3c) a également montré le regroupement basé sur le médicament et la combinaison. Nous avons observé deux clusters principaux, l'un correspondant à des combinaisons incluant YM155, tandis que l'autre était dominé par les échantillons traités au Trametinib. En analysant les associations entre les changements d'activité des voies et les médicaments (Fig. 3d), nous avons constaté une diminution de l'activité de la voie Hypoxia dans tous les échantillons traités au YM155, tandis que tous les échantillons traités au Trametinib (inhibiteur de MAPK) présentaient une forte inactivation de MAPK (Fig. 3e, p valeur d'un modèle linéaire : 0, 03) et des voies EGFR associées. De plus, lors de la corrélation des scores d'activité de la voie MAPK du petit écran 4 × 4 (Fig. 3e) et de l'écran 4 × 4 permuté (Fig. 9e supplémentaire), nous avons trouvé une corrélation significative (r = 0, 637, p = 0, 01), démontrant détection reproductible des activités de la voie (Fig. 3f). L'analyse de la voie suggère que les changements d'expression génique observés correspondent au mécanisme d'action connu des médicaments utilisés, que nous décrivons plus en détail dans la discussion ci-dessous. En résumé, les résultats appuient l'utilisation de notre méthode de dépistage pour analyser les changements d'expression génique induits par la combinaison d'une manière à haut débit, permettant la caractérisation des réponses aux médicaments de manière beaucoup plus détaillée par rapport aux tests phénotypiques utilisés précédemment.

Afin d'évaluer la robustesse du pipeline Combi-Seq, nous avons comparé les activités de voie du criblage de médicaments 4 × 4 Combi-Seq dans les gouttelettes aux activités du même criblage effectué dans une plaque multipuits (nombre médian de lecture 1,07 × 106). Le regroupement hiérarchique des corrélations entre les activités de la voie à partir des données en vrac (Fig. 11 supplémentaire) et des gouttelettes (Fig. 3c) a abouti à deux groupes principaux entraînés par des corrélations positives dans les activités de la voie : pour les deux formats, un groupe a été formé par des corrélations positives entre les cellules traitées au YM155 et l'autre groupe a été entraîné par des corrélations positives des traitements à l'Imatinib (Fig. 4a). Par conséquent, nous avons pu démontrer que les écrans de médicaments à base de gouttelettes à faible entrée utilisant un séquençage peu profond comme lecture capturent les principales caractéristiques des données de séquençage profond à haute entrée en vrac au niveau fonctionnel des activités de la voie. De plus, nous avons comparé la stratégie de codage à barres Combi-Seq avec la capture d'ARNm conventionnelle à base de polyA (PolyA) dans le format en vrac. L'expression génique entre les données Combi-Seq et PolyA a montré des coefficients de corrélation entre 0,576 et 0,646 (Fig. 12 supplémentaire), comparables aux résultats des comparaisons précédentes de différentes approches de séquençage RNA-Seq (par exemple, Prime-Seq vs. True-Seq : R2 = 0,64)20, ce qui suggère que l'approche Combi-Seq n'introduit pas de biais majeurs lors des étapes de préparation de la bibliothèque.

une carte thermique des corrélations entre les activités de la voie des données Combi-Seq en vrac et en gouttelettes : les activités de la voie PROGENy ont été déterminées pour chaque échantillon et les corrélations pour les échantillons appariés à l'aide de données obtenues dans des plaques de microtitrage (rangées) ou des gouttelettes (colonnes) ont été calculées (code de couleur bleu à rouge) et utilisées pour effectuer un regroupement hiérarchique. Les médicaments des combinaisons sont codés par couleur (vert clair : médicament de l'échantillonneur automatique, bleu : médicament des valves braille, cyan : même médicament de l'échantillonneur automatique et des valves braille). b Précision de la détection de pointe en tant que corrélation entre la concentration d'entrée d'ERCC et les transcriptions mesurées par million (TPM) pour 250 cellules par échantillon, la zone ombrée montre un intervalle de confiance à 95 % de l'estimation de régression. (c) Résumé des coefficients de corrélation pour 125 (R = 0,63 et R2 = 0,40), 250 (R = 0,65 et R2 = 0,42) et 500 cellules (R = 0,7 et R2 = 0,49) par échantillon, n = 5 expériences biologiques indépendantes, les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes ± intervalle de confiance à 95 %. d Sensibilité en tant que probabilité de détection des molécules de pointe pour 250 cellules par échantillon. Un pic d'activité était considéré comme détecté lorsque la probabilité atteignait 50 %. e Résumé des sensibilités pour différentes quantités (125, 250 et 500) de cellules par échantillon, n = 5 expériences biologiques indépendantes, les données ont été présentées sous forme de valeurs moyennes ± intervalle de confiance à 95 %. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Pour tester la sensibilité et la précision de l'approche Combi-Seq, nous avons en outre utilisé une bibliothèque de 92 séquences d'ADN différentes du External RNA Controls Consortium (ERCC). Nous avons injecté des molécules ERCC dans des gouttelettes et analysé la précision (Fig. 4b, corrélation entre la concentration de la molécule ERCC et l'expression mesurée) et la sensibilité (Fig. 4d, le seuil de détection de la molécule ERCC). Nous avons observé une précision croissante (Fig. 4c, 0,63, 0,65, 0,7 corrélation de Pearson pour 125, 250 et 500 cellules d'entrée, respectivement) et une sensibilité (Fig. 4e, 2,55, 2,06 et 1,48 log10 (attomoles/ul) limite de détection pour 125, 250 et 500 cellules d'entrée, respectivement) de la méthode Combi-Seq avec un matériau d'entrée accru (nombre de cellules par gouttelette, où la quantité de pointes d'ERCC ajoutées a été augmentée proportionnellement au nombre de cellules). Ces résultats se situent dans la fourchette des autres approches RNA-Seq à faible apport21.

Sur la base des résultats prometteurs de l'expérience de combinaison de médicaments 4 × 4, nous avons effectué un criblage à haut débit, en utilisant un total de 420 conditions de traitement combinatoire différentes. Pour cette étude, nous avons délibérément sélectionné des médicaments avec de faibles valeurs de logD (Fig. 13 supplémentaire et données supplémentaires). De cette façon, l'échange indésirable de composés typiquement hydrophobes peut être minimisé22. De plus, nous avons effectué une série d'expériences systématiques pour tester si l'échange de médicaments a un impact sur notre lecture. En particulier, nous avons mélangé des gouttelettes contenant uniquement un médicament et des cellules (traitées) avec des gouttelettes contenant uniquement du DMSO et des cellules (contrôles DMSO) et les avons incubées pendant 24 h à 37 ° C (Fig. 14a supplémentaire). De plus, des gouttelettes avec du DMSO et des cellules ont été incubées et traitées séparément comme contrôle positif pour un phénotype non traité (contrôles DMSO séparés). Par la suite, les cellules ont été lysées et les codes-barres ligaturés pour effectuer une transcription inverse pour le séquençage du transcriptome entier (Fig. 14b supplémentaire). Les projections des données à l'aide d'UMAP ont séparé les échantillons traités des échantillons de contrôle DMSO, la majorité des échantillons de contrôle DMSO se regroupant (Fig. 14c supplémentaire). Cela indique que sur une période d'incubation de 24 h, l'effet des médicaments ne peut être observé que pour les gouttelettes qui contenaient le médicament en premier lieu, mais pas pour les gouttelettes qui ne contenaient que du DMSO. De manière convaincante, les échantillons de DMSO non traités qui ont été incubés avec des gouttelettes contenant des médicaments, se sont bien regroupés avec les contrôles DMSO qui ont été manipulés séparément, même pour les médicaments avec des valeurs LogD positives telles que l'Imatinib. Afin d'estimer les concentrations optimales de médicaments pour les écrans combinatoires à grande échelle, nous avons généré des courbes dose-réponse à l'aide de cellules K562 pour déterminer leurs valeurs d'inhibition de croissance de 35 % (GR) pour chaque médicament. Par rapport à la métrique traditionnelle, la valeur IC50, le GR50 (ou, dans notre cas, le GR35) n'est pas sensible au nombre de divisions qui se produisent pendant les traitements médicamenteux, qui peut varier en fonction des lignées cellulaires et des conditions (Données supplémentaires)23. Les médicaments ont été assignés aux valves Braille ou à l'échantillonneur automatique pour obtenir une distribution équilibrée des médicaments avec des valeurs GR35 élevées et basses. Les médicaments chargés sur les valves Braille ou l'échantillonneur automatique ont été complétés par BC-RT ou BC-PCR, respectivement. Notre objectif était de générer 250 gouttelettes contenant une seule cellule pour chacune des 420 conditions de traitement et des gouttelettes incubées pendant 12 h à 37 ° C avant d'effectuer une picoinjection pour la lyse cellulaire, les ligatures de codes à barres et la RT (Fig. 1a). Ce processus a été effectué trois fois pour obtenir des répliques.

Après le prétraitement initial et le contrôle qualité (lectures médianes et gènes par échantillon de 32892 et 547, respectivement, Fig. 15 supplémentaire), nous avons effectué la même réduction de dimensionnalité (Fig. 5a) et analyse de silhouette (Fig. 5b), que pour l'écran 4 × 4. Encore une fois, les échantillons se regroupaient significativement mieux en fonction de la combinaison utilisée que prévu de manière aléatoire (valeurs p des scores de silhouette par rapport à la distribution aléatoire : <0,01, 0,47 et <0,01 pour le médicament de l'échantillonneur automatique, le médicament des valves braille et la combinaison, respectivement). Nous avons également constaté que le faible nombre de cellules n'avait pas d'incidence sur la capacité à distinguer les cellules traitées des cellules non traitées sur la base de l'expression génique (Fig. 16a supplémentaire).

a Tracés TSNE de données d'expression génique normalisées. Les échantillons traités avec la combinaison YM155 (panneau de gauche), Blebbistatin (panneau du milieu) et YM155-Blebbistatin sont étiquetés en tant qu'exemples représentatifs. b Scores de silhouette de regroupement d'échantillons basés sur des médicaments et des combinaisons d'échantillonneurs automatiques/valves braille. Les scores des silhouettes sont comparés à des distributions aléatoires (code couleur) créées en permutant des étiquettes d'échantillon. ( c ) Analyse ROC de la similitude de la signature du médicament avec les données LINCS-L1000. Pour chaque médicament, une signature consensuelle a été calculée et la similarité (corrélation de rang de Spearman) avec les signatures LINCS-L1000 correspondantes a été calculée. Les valeurs de similarité ont été utilisées comme valeurs prédites pour l'analyse ROC, tandis que les vrais positifs étaient les paires de médicaments appariées entre le criblage à haut débit et LINCS-L1000. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Pour étudier plus avant si les valeurs d'expression génique du criblage à haut débit sont biologiquement significatives, nous avons comparé les signatures d'expression génique obtenues à celles disponibles pour les mêmes médicaments dans l'ensemble de données public LINCS-L10008. Comme LINCS-L1000 ne contient que des signatures d'expression de traitements médicamenteux en monothérapie, nous avons calculé les signatures consensuelles pour chaque médicament de notre criblage à haut débit (Methods Functional genomic analysis of gene expression signatures) et les avons comparées aux signatures consensuelles générées à partir de la base de données LINCS-L1000 sur toutes les lignées cellulaires et doses de concentration disponibles (notez que LINCS-L1000 n'inclut pas les données obtenues directement à partir des cellules K562). Pour 32 médicaments utilisés dans notre crible microfluidique, des données correspondantes sur LINCS-L1000 étaient disponibles. Pour comparer les similitudes de signature de ceux-ci, nous avons calculé les coefficients de corrélation de Spearman pour toutes les paires de médicaments dans les deux ensembles de données. Notre analyse ROC a montré que les signatures des mêmes médicaments des deux écrans (vrais positifs) sont plus similaires que les signatures de paires de médicaments non apparentées (Fig. 5c, ROC AUC : 0,59), et cette zone sous la courbe ROC est statistiquement significative par rapport à une distribution aléatoire créée en permutant les étiquettes de médicaments (Fig. 17 supplémentaire, p = 0,019).

Pris ensemble, nous avons démontré que pour le dépistage combinatoire de médicaments à haut débit, l'injection (valve Braille ou échantillonneur automatique) et le mode de codage à barres ne biaisaient pas les données et que la corrélation des signatures de médicaments entre nos données et LINCS-L1000 présentait une similitude significative. Par conséquent, nous avons conclu que notre approche Combi-Seq peut être appliquée pour effectuer des criblages de médicaments combinatoires à grande échelle en utilisant un matériau d'entrée faible et un ARN-seq peu profond comme lecture.

Comme toutes les concentrations de médicament utilisées étaient des valeurs GR35, nous nous attendions à ce que les combinaisons synergiques puissent entraîner une diminution de la viabilité cellulaire, tandis que dans le cas des combinaisons antagonistes, nous nous attendions à une augmentation des valeurs de viabilité cellulaire. Bien que nous n'ayons pas mesuré directement la viabilité cellulaire, l'algorithme CEVIChE (Methods Functional genomic analysis of gene expression signatures)18 nous a permis de déduire les changements de viabilité cellulaire pour toutes les combinaisons de médicaments utilisées à partir des données d'expression génique (Fig. 18 supplémentaire), qui a fonctionné de manière robuste pour un faible nombre de cellules et était indépendant du pourcentage de gènes mitochondriaux détectés (Figs. 16b, 19 supplémentaires). En comparant les diminutions de viabilité prévues entre les combinaisons de médicaments et les traitements médicamenteux uniques, nous avons déterminé les scores de synergie pour les 420 combinaisons (Fig. 6a). Nous avons trouvé plusieurs groupes de combinaisons potentielles synergiques et antagonistes (par exemple : Triciribine-Dacarbazine et Razoxane-Trametinib, respectivement). Pour valider expérimentalement les prédictions sur la synergie du criblage de médicaments à haut débit, nous avons effectué des cribles combinatoires de viabilité cellulaire à matrice de doses 5 × 5 avec toutes les combinaisons possibles de triciribine, YM155, Razoxane et Doxorubicine avec Dacarbazine, Imatinib et Trametinib dans un format de plaque de microtitration.

une carte thermique montrant les scores de synergie prédits qui ont été déterminés en comparant les viabilités des 420 combinaisons de médicaments aux traitements médicamenteux uniques correspondants. b Corrélation entre la viabilité cellulaire expérimentale et prédite (corrélation de Pearson r = 0,66, p = 0,018, R2 = 0,44). La synergie des médicaments (axe y) a été mesurée pour 12 combinaisons dans un format de plaque de microtitration (code couleur) et tracée par rapport à la valeur de synergie prédite (axe x), la zone ombrée montre un intervalle de confiance à 95 % de l'estimation de régression. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Nous avons calculé les scores de synergie (positif : synergique, négatif : antagoniste) pour les 12 combinaisons testées à l'aide du modèle de synergie d'indépendance de Bliss (Methods Plate-based viability measure to valid hits from the microfluidic screen)24. Parmi les 12 combinaisons validées, l'antagonisme était plus fréquent, ce qui est comparable aux données publiées précédemment (Fig. 20 supplémentaire). Nos 12 synergies mesurées (expérience sur plaque) et prédites (à partir des données d'expression génique obtenues dans le système microfluidique) ont montré une corrélation significative (Fig. 6b, corrélation de Pearson r = 0, 66, p = 0, 018, voir le tableau supplémentaire 2 pour les valeurs sans Razoxane-Trametinib). La comparaison a confirmé que les combinaisons de trametinib et d'inhibiteurs de la topoisomérase 2 présentent des effets antagonistes, tandis que l'inhibition de BCR-ABL (imatinib) est synergisée avec une induction accrue de l'apoptose en inhibant la survivine avec YM155, confirmant davantage le potentiel de découverte de notre plateforme Combi-Seq.

En résumé, à l'aide de notre plate-forme d'expression génique microfluidique combinatoire, nous avons montré que (i) le groupe de valeurs d'expression génique mesurée en fonction de la perturbation chimique, (ii) les données résultantes sont en bon accord avec les profils de perturbation de la monothérapie publique, et (iii) les viabilités cellulaires prédites et les synergies médicamenteuses pourraient être validées dans un format de plaque multipuits pour les hits sélectionnés. Pris ensemble, cela illustre comment des informations complètes peuvent être obtenues à partir de profils d'expression génique obtenus dans un format microfluidique hautement multiplexé, séquençant seulement environ 250 cellules par traitement médicamenteux. Cela devrait rendre le flux de travail particulièrement intéressant pour une utilisation avec un matériel très limité, tel que des échantillons de patients.

La stratification des patients atteints de cancer pour personnaliser les traitements avec des chimiothérapies et des médicaments ciblés a montré qu'elle augmentait le succès des thérapies contre le cancer25,26,27. Ces efforts sont largement motivés par la dissection du paysage génomique et transcriptionnel des tumeurs ou des lignées cellulaires afin d'identifier les traits qui expliquent les sensibilités aux médicaments28,29. Bien qu'une variété de marqueurs génomiques et/ou transcriptomiques identifiés soient utilisés avec succès dans les cliniques, ils ne sont disponibles que pour un petit sous-ensemble de types de tumeurs et de patients1. De plus, de nombreux patients souffrent souvent de rechute tumorale30, qui est largement enracinée dans l'hétérogénéité intra-tumorale31. La rechute est souvent provoquée par la poussée d'un mécanisme de résistance au médicament qui rend l'efficacité d'un seul médicament de courte durée32. Alors que les traitements avec des combinaisons de médicaments offrent le potentiel de réduire le risque de résistance aux médicaments, leur prédiction et leur évaluation empirique restent difficiles.

Pour avancer dans la résolution de ces défis, nous présentons ici un pipeline microfluidique permettant des écrans de médicaments combinatoires hautement multiplexés dans des gouttelettes unicellulaires en utilisant la transcriptomique globale comme lecture. En intégrant le code-barres déterministe des conditions de traitement, nous avons pu évaluer l'efficacité des combinaisons de médicaments par des changements dans l'expression des gènes et obtenu des lectures complètes du séquençage du transcriptome entier. Nous avons appliqué notre pipeline pour cribler 420 conditions de traitement combinatoire dans un seul tube, illustrant le niveau élevé de multiplexage. Sur la base de la miniaturisation du test dans un format de gouttelettes, seulement environ 250 cellules étaient nécessaires par condition testée, ouvrant ainsi la voie à des écrans personnalisés directement sur le matériel du patient et augmentant considérablement l'échelle à laquelle les écrans combinatoires peuvent être effectués sur des lignées cellulaires dérivées de patients ou des organoïdes et des sphéroïdes.

Nous avons conçu la plate-forme microfluidique comme un système modulaire dans lequel les valves d'affichage braille nous permettent de changer rapidement entre les médicaments injectés en surmontant les limites d'une injection lente basée sur un échantillonneur automatique. Étant donné que les deux sont combinés sur le générateur de gouttelettes, la génération rapide et efficace de combinaisons de médicaments devient réalisable et permet l'encapsulation de cellules individuelles dans des gouttelettes de grande diversité chimique. Étant donné que l'échantillonneur automatique utilisé ici injecte des médicaments à partir de jusqu'à trois plaques de 96 ou même 384 puits, le nombre de combinaisons de médicaments peut encore être augmenté jusqu'à un maximum théorique de 3 × 384 × 20 = 23 040 combinaisons dans une seule expérience. Ce qui devient le plus limitant à cette échelle, ce sont les coûts de séquençage et le matériel disponible (lorsque, par exemple, l'utilisation de cellules primaires) plutôt que le débit de l'instrument.

Nous voyons un potentiel supplémentaire significatif par la possibilité de cribler un si grand nombre de combinaisons de médicaments au niveau d'une seule cellule : l'intégration du tri des gouttelettes basé sur la fluorescence en amont de l'étape de picoinjection (lyse cellulaire) pourrait, par exemple, être utilisée pour séparer physiquement et séquencer les clones résistants pour les 420 options de traitement dans une seule expérience (par exemple, la mise en œuvre du test phénotypique Caspase-3 que nous avons utilisé précédemment)14. De cette façon, on pourrait analyser la différence de leur signature transcriptomique par rapport aux cellules répondantes, ouvrant la voie à des études hautement multiplexées pour révéler de nouveaux biomarqueurs de résistance et des sensibilisateurs (chimiques) pour les surmonter. Comme récemment démontré, les lectures unicellulaires de la perturbation médicamenteuse fournissent d'excellentes informations sur la réponse médicamenteuse hétérogène11. La réalisation de tels criblages sur des biopsies de patients nous permettra de disséquer l'impact de l'hétérogénéité tumorale sur les réponses aux médicaments et ainsi de définir des combinaisons de médicaments plus efficaces et de mieux comprendre leurs mécanismes de résistance potentiels. Afin de permettre l'encapsulation des cellules tumorales primaires (ou fragments microscopiques) et/ou leur expansion en sphéroïdes, nous visons à intégrer des structures de support pour l'adhérence cellulaire et la croissance en gouttelettes comme indiqué précédemment33,34.

Tous les ensembles de données générés démontrent que ni l'approche de codage à barres ni le mode d'injection n'ont biaisé la lecture basée sur l'expression des gènes. Les monothérapies des modes d'injection et de codage à barres avaient des impacts similaires, tandis que leurs combinaisons avaient le plus fort impact sur l'expression des gènes et étaient le principal moteur du regroupement observé. Cela confirme le fonctionnement très précis et précis du flux de travail microfluidique présenté et la spécificité de l'approche déterministe de codage à barres. De plus, nous avons trouvé des similitudes significatives entre les signatures d'expression génique consensus des monothérapies de notre écran à grande échelle avec les signatures de médicaments de l'ensemble de données LINCS-L1000, illustrant un haut niveau de reproductibilité. Dans l'analyse de l'activité de la voie, nous avons constaté que le regroupement hiérarchique était largement motivé par les trois médicaments YM155, Imatinib et Trametinib, ce qui appuie davantage la détection d'effets spécifiques aux médicaments. Les deux principaux groupes étaient motivés par les traitements au trametinib inhibant les activités des voies MAPK et EGFR, et les effets opposés des traitements YM155, induisant les régulations à la hausse des activités des voies MAPK et EGFR tout en inhibant l'hypoxie et les voies liées au TRAIL. Alors que les effets du trametinib sur MAPK sont attendus35, les effets de l'inhibition de la survivine par YM155 sont moins bien compris, en raison d'une signalisation complexe et d'une connaissance incomplète de la survinine36. L'activité accrue de la voie MAPK est susceptible de refléter un mécanisme contre-actif puisque l'expression de la survivine a été décrite comme étant régulée par l'activation de Sp1 et c-Myc via la voie MAPK37, et une concentration plus élevée de la cible médicamenteuse réduira l'effet médicamenteux. Comme l'expression de la survinine a été liée à la résistance aux médicaments dans la leucémie, un traitement combiné avec YM155 et Trametinib pourrait potentiellement avoir un effet bénéfique sur la diminution des risques de rechute, en raison de l'inhibition de la survivine et de l'expression compensatoire putative induite par la voie MAPK. Pris ensemble, ces résultats montrent que le pipeline microfluidique décrit peut être appliqué pour démêler les effets des combinaisons de médicaments sur les activités de la voie. Ces informations auront un impact important lors du dépistage des biopsies de patients afin d'identifier les mécanismes de résistance potentiels et de prédire les paires de médicaments efficaces. L'analyse des activités de la voie lors de perturbations était limitée par le nombre de gènes détectés et, par conséquent, aux petits écrans 4 × 4, puisque ces échantillons ont été séquencés à une profondeur plus élevée. Pour détecter un nombre comparable de gènes pour les 420 combinaisons de médicaments, une couverture dix fois supérieure aurait été nécessaire. Nous avons plutôt utilisé le grand écran pour montrer que les données de séquençage peu profondes sont suffisantes pour déterminer les paires de médicaments synergiques. Nous avons extrait l'ensemble de données avec 420 conditions de traitement pour des paires de médicaments ayant des effets synergiques ou antagonistes. Nous avons constaté que la combinaison de trametinib avec des inhibiteurs de la topoisomérase 2 (Top2) (Doxorubicine ou Razoxane) a des effets antagonistes (Fig. 6b). Nous émettons l'hypothèse que l'inhibition de la voie MAPK par le trametinib et l'arrêt du cycle cellulaire G1 qui en résulte contrecarrent les dommages à l'ADN normalement causés par l'inhibition de Top2 lorsque les cellules entrent dans la phase S suivante. Parmi les combinaisons synergiques prédites et validées, nous avons trouvé la combinaison de Triciribine avec Dacarbazine et YM155 avec Imatinib parmi les meilleurs résultats (Fig. 6b). BCR-ABL (la cible de l'imatinib) a déjà été associé à une régulation positive de l'expression de la survivine (la cible de YM155)38. Par conséquent, il a été constaté que le silençage antisens de la survivine réduisait la viabilité et augmentait l'efficacité du traitement par l'imatinib dans les lignées cellulaires de leucémie myéloïde chronique (LMC), ainsi que dans les progéniteurs myéloïdes de patients atteints de LMC39,40. En confirmant une combinaison de traitement efficace décrite précédemment pour la LMC, qui a le potentiel de prévenir l'apparition de la résistance à l'imatinib, nous illustrons davantage le potentiel de notre pipeline dans l'identification de paires de médicaments cliniquement pertinentes. En outre, nous avons validé qu'il existe une bonne corrélation entre les scores de viabilité à partir des données d'expression génique et les scores de synergie validés expérimentalement obtenus à partir du criblage de médicaments sur plaque. Ces résultats montrent qu'il est possible d'utiliser une faible profondeur de séquençage rentable dans de grands écrans transcriptomiques pour découvrir des paires de médicaments synergiques.

Avec les activités de voie déduites sous perturbation, cela devrait non seulement permettre l'identification de combinaisons synergiques, mais également mieux comprendre leurs mécanismes d'action. Par rapport à notre précédente plate-forme de test phénotypique à mesure unique14, la lecture transcriptomique globale fournit des ordres de grandeur de plus de points de données par échantillon, tandis que la consommation de cellules pourrait être encore réduite d'un facteur d'environ six fois. Les lectures de contenu plus élevées devraient permettre des prédictions plus robustes sur les meilleurs traitements combinatoires et la découverte de nouveaux sensibilisants médicamenteux et biomarqueurs, et les besoins encore plus réduits en matériel facilitent encore l'application en clinique pour la stratification des patients et la priorisation des traitements.

Tous les dispositifs utilisés pour le module de valve ont été reproduits à partir de moules préparés par lithographie douce avec un photorésist positif AZ-40XT (Microchemicals) conformément aux instructions du fabricant. Les structures de photomasques de 25400 dpi (Selba) ont été modelées sur des tranches de silicium de 4 pouces (Siltronix) dans un aligneur de masque (Suess MicroTec MJB3) en utilisant une lumière d'une longueur d'onde de 375 nm. Les structures ont été recouvertes d'une couche d'environ 1 cm d'épaisseur de PDMS mélangée à un agent de durcissement dans un rapport de 1:10 (kit d'élastomère Sylgard 186, Dow Corning Inc) et durcies pendant une nuit à 65 ° C. De plus, nous avons préparé des membranes PDMS en mélangeant du PDMS avec un agent de durcissement dans un rapport de 1:10 et en le distribuant sur une feuille transparente à l'aide d'un spin coater à 500 tr/min (Laurell WS 650), qui ont été durcis pendant la nuit à 65 ° C. L'entrée de médicament et les orifices d'évacuation de la puce de valve ont été perforés à l'aide de poinçons à biopsie de 0, 75 mm (Harris Unicore), tandis que l'orifice de sortie du bouchon a été perforé horizontalement par rapport aux canaux de sortie à l'aide d'un poinçon à biopsie de 0, 5 mm (Harris Unicore). Les puces ont été collées sur une membrane PDMS à l'aide d'un four à plasma (Diener Femto). Nous avons inséré des tubes en PTFE d'un diamètre intérieur de 0,4 mm (Adtech) dans l'orifice de sortie perforé horizontalement jusqu'à ce que le tube atteigne la structure en forme d'entonnoir du canal de sortie. Par la suite, les puces ont été liées à une lame de verre pour supporter des structures de puce avec des entrées et des sorties. Afin d'éviter le mouillage de la surface, les canaux ont été traités avec Aquapel (PGG Industries) avant utilisation. Les structures de valve des puces Braille ont été alignées (Fig. 2a supplémentaire) au-dessus des broches d'un afficheur Braille (KGS Corporation, Fig. 21a supplémentaire) et montées à l'aide d'un support en plexiglas (Fig. 21b supplémentaire). Utilisation de notre logiciel LabVIEWTM 2013 "CombinatorialPlugFluidics" (tous les logiciels nécessaires peuvent être téléchargés sur www.epfl.ch/labs/lbmm/downloads). le mouvement des broches était contrôlé, de sorte que l'ouverture du canal de collecte entraînait la fermeture du canal de déchets et inversement. La fermeture d'un canal a été réalisée par une broche poussant dans la membrane élastique PDMS. Cela pourrait être ouvert à nouveau en déplaçant la goupille vers le bas. Pour toutes les expériences, nous avons utilisé 20 seringues (Becton Dickinson) remplies de 5 ml de solutions de code-barres de médicament et quatre seringues remplies de 5 ml d'huile HFE (Novec™ 7500, 3 M). Ceux-ci ont été connectés aux orifices d'entrée de la puce de valve avec un tube en PTFE, et des fluides ont été injectés à 500 µl h-1 à l'aide de pompes à seringue (Harvard Apparatus). Les sorties de déchets étaient reliées à un morceau de tube en PTFE pour diriger les fluides vers un conteneur de déchets.

Les moules de fabrication de gouttes ont été fabriqués à partir de photorésist négatif SU-8 2075 comme décrit par le fabricant (Microchemicals). Du PDMS contenant un agent de durcissement à 10 % (p/p) a été versé sur les moules et durci pendant la nuit. Les ports d'entrée pour les cellules et le HFE ont été perforés verticalement à l'aide de poinçons de biopsie de 0,75 ou 1 mm pour les tubes PEEK provenant de la connexion de l'échantillonneur automatique. Les orifices d'entrée pour les bouchons composés des valves Braille ont été perforés horizontalement à l'aide de poinçons de 0,5 mm. Les puces ont d'abord été liées au plasma à une membrane PDMS, puis à une lame de verre. L'hydrophobicité de la paroi du canal a été augmentée en injectant Aquapel (PGG Industries) dans les canaux.

Pour faciliter l'injection de médicaments à partir de plaques de microtitration dans le dispositif de fabrication de gouttes, nous avons utilisé un échantillonneur automatique Dionex 3000SL aspirant des médicaments à partir d'une plaque à 96 puits. L'échantillonneur automatique a été programmé pour aspirer séquentiellement 310 ul du composé des puits dans une boucle d'échantillon de 125 ul. Le grand excès de volume aspiré représentait un volume d'aiguille de 60 µl et un facteur de débordement de boucle de 2. En remplissant excessivement la boucle d'échantillon de deux fois son volume, nous nous sommes assurés que le mélange composé restant n'était pas dilué par les fluides porteurs qui restent dans la boucle d'échantillon après chaque cycle en raison du lavage. L'injection de composés de la boucle d'échantillon dans le fabricant de gouttelettes a été pilotée par une pompe à seringue (Harvard Apparatus) injectant du PBS (Thermo Fisher) à 500 µl h-1. Après l'aspiration d'un médicament, un délai a commencé pour s'assurer que chaque médicament est injecté et combiné avec tous les médicaments de l'afficheur braille avant que le médicament suivant ne soit aspiré.

Des séquences d'ADN aléatoires de 10 nt de long avec des distributions de bases équilibrées ont été générées à l'aide de l'outil bgen (gear.embl.de). Les amorces PCR à code-barres ont été fonctionnalisées avec une biotine à l'extrémité 5' pour la purification, suivie d'une séquence d'espacement, d'une séquence d'amorce commune, d'une séquence de code-barres unique et d'un site de ligature (tableau 2). Les compléments inverses (RC) ont été fonctionnalisés avec un phosphate libre à l'extrémité 5' pour permettre la ligature. Les amorces RT à code-barres comprenaient une séquence dT(20)-VN, une séquence de code-barres unique et un groupe phosphate à l'extrémité 5'. Le RC pour cela avait un site de ligature complémentaire du site de ligature des amorces de PCR. Une liste de toutes les séquences de codes à barres se trouve dans les documents supplémentaires. Les séquences complémentaires ont été recuites à des concentrations équimolaires en chauffant les mélanges à 95 ° C pendant 10 min dans un bloc thermique (Eppendorf) suivi de leur refroidissement à température ambiante (RT) pendant 1 h.

Des mélanges de code-barres et de médicaments pour le module de valve ont été préparés en diluant des amorces RT à code-barres dans un milieu FreeStyle (Thermo Fisher) à 1 µM. Les médicaments dissous dans du DMSO ont été ajoutés à leur code-barres correspondant à 2x les concentrations finales (voir matériaux supplémentaires). Les mélanges de code-barres et de médicaments ont été complétés par Cascade-Blue (Thermo Fisher) ou Alexa-488 (Thermo Fisher) à 10 µM à des fins de surveillance, puis aspirés dans des seringues luer-lock de 5 ml (BD) connectées à des tubes en PTFE à l'aide d'aiguilles de 27 G ¾ (BD). Des mélanges de code-barres-médicaments pour l'injection à base d'échantillonneur automatique ont été préparés dans des plaques à 96 puits à fond rond en diluant les amorces PCR à code-barres à 4 µM dans un milieu FreeStyle et les médicaments correspondants à 4x les concentrations finales. Les mélanges ont été complétés avec Alexa-488 à 10 µM et les plaques ont été scellées avec des joints adhésifs qPCR (Thermo Fisher).

Des cellules K562 (ATCC, CCL-243) ont été cultivées dans du milieu IMDM (Thermo Fisher) additionné de 10 % de FBS (Thermo Fisher) et de 1 % de pénicilline-streptomycine (Thermo Fisher). Le jour des expériences, les cellules ont été lavées deux fois dans du PBS et remises en suspension dans du FreeStyle Media (Thermo Fisher) additionné de 4 % de FBS. La concentration de la suspension cellulaire a été ajustée à 2 × 106 cellules ml-1 puis aspirée dans une seringue luer-lock de 3 ml (BD).

Les seringues contenant des mélanges médicament-code-barres et de l'huile HFE ont été connectées à la puce de la valve braille, comme indiqué sur la figure 1c, et toutes injectées à 500 µl h-1. Le mode par défaut pour toutes les vannes composées était de diriger les fluides vers les sorties de déchets et deux vannes d'huile HFE pour diriger les fluides vers la tubulure de sortie. La longueur du tube de sortie de la valve Braille a été ajustée pour abriter les 20 bouchons composés espacés d'huile HFE, puis connectés à l'entrée Braille sur la puce de marqueur de goutte (Fig. 21b supplémentaire). Une seringue contenant des cellules a été montée sur une pompe et connectée au drop-maker et injectée à 500 µl h-1. La sédimentation cellulaire a été empêchée par des rotations à basse vitesse du disque magnétique à l'aide du système Multi Stirrus™ (VP Scientific). Les tubes de sortie de l'échantillonneur automatique et la phase porteuse HFE complétée par 1% de Pico-Surf1 (Sphere Fluidics) ont été connectés via les entrées respectives et injectés à 500 et 6000 µl h-1, respectivement. La puce de fabrication de gouttelettes a été montée sur un microscope (Nikon, Eclipse Ti2-E) avec une configuration optique pour mesurer les intensités de fluorescence des bouchons composés ou des gouttelettes14. Des lasers d'une longueur d'onde de 375 ou 488 nm ont été utilisés pour exciter les colorants et la lumière émise (450 ou 520 nm) a été mesurée à l'aide de tubes photomultiplicateurs. Les lasers ont été focalisés sur l'une des trois positions (M1 à M3) illustrées à la Fig. 1c pour mesurer les colorants fluorescents qui ont été injectés avec les mélanges médicament-code-barres dans le fabricant de gouttes. Aux positions M1 et M2, les signaux de fluorescence ont été enregistrés à l'aide du logiciel PlugAcquisition LabViewTM 2014. Les signaux de fluorescence des gouttelettes ont été acquis en position M3 à l'aide du logiciel DropletAcquisition LabViewTM 2014 (tous les logiciels nécessaires peuvent être téléchargés sur www.epfl.ch/labs/lbmm/downloads).

Un fichier CSV contenant la séquence d'ouverture de la vanne braille (tableau 3) a été chargé dans l'exemple de logiciel à la demande. Le nombre de cycles a été fixé à 21 puisque nous combinions les 20 médicaments des valves Braille avec 21 médicaments d'une plaque à 96 puits. Une fois que tous les tubes ont été connectés et que les fluides ont été injectés dans le marqueur de goutte (fluide porteur de l'échantillonneur automatique et huile HFE des vannes braille), la production de bouchons et l'injection basée sur l'échantillonneur automatique ont démarré simultanément. 20 bouchons ont été produits dans la tubulure de retard (180 s) puis injectés dans le drop-maker, en ouvrant deux vannes d'huile HFE (débit tot. de 1000 µl h-1). Cela a assuré un débit continu et stable pour les injections de bouchons et, par conséquent, a entraîné un flux laminaire de composés provenant des vannes Braille, des composés de l'échantillonneur automatique et des cellules à partir desquelles des gouttelettes ont été générées à la jonction de focalisation du flux (Film S1). Des gouttelettes d'environ 800 pl ont été recueillies dans un tube Eppendorf qui a été conservé sur de la glace. Une fois que 420 combinaisons ont été générées (~ 100 min), le tube Eppendorf a été placé dans un incubateur humidifié à 37 ° C et une atmosphère à 5 % de CO2 pour incuber les cellules pendant 12 h.

Des puces pour picoinjection ont été produites en reproduisant des moules SU-8 en utilisant du PDMS avec un agent de durcissement comme décrit ci-dessus. Les moulages ont été liés au plasma à des lames de verre et traités avec Aquapel. Les puces ont été chauffées à 95 ° C et la première soudure à faible point de fusion et les deuxièmes câbles ont été insérés dans les ports des deux électrodes (Fig. 22 supplémentaire). La puce a été montée sur le microscope d'une station microfluidique et l'électrode de puissance a été connectée à un amplificateur haute tension, tandis que la puce a été mise à la terre sur l'électrode de mise à la terre.

Après une incubation de 12 h, des gouttelettes contenant des cellules, des combinaisons de médicaments et des codes-barres ADN correspondants ont été transférées dans une seringue de 3 ml et injectées par le port d'entrée des gouttelettes dans une puce de picoinjection (Fig. 2 supplémentaire). Les gouttelettes ont été rincées à 180 µl h-1 et les gouttelettes individuelles ont été espacées en injectant de l'huile HFE avec 1 % de surfactant PicoSurf à 700 à 1000 µl h-1 sur l'entrée d'huile. Pour la lyse cellulaire, la ligature des codes-barres et la transcription inverse de l'ARNm libéré des cellules lysées, nous avons pico-injecté un mélange réactionnel contenant 0,9 % d'Igepal (Sigma Aldrich), 3x tampon de ligation (NEB), 60 000 U/µl T4 Ligase (NEB), 1,5 mM dNTP (Thermo Fisher), 7,5 µM Template Switching Oligonucleotide (IDT), 12 U/µ l Maxima -H reverse transcriptase (Thermo Fisher) et 6000 U/µl NxGen RNase Inhibitor (Lucigen). Les débits du mélange de réactifs ont été ajustés en fonction de la fréquence et de la taille des gouttelettes afin d'injecter l'équivalent de 1/3 du volume final des gouttelettes (Film S3). Afin de réaliser l'injection de réactifs dans les gouttelettes passant par la buse d'injection, nous avons appliqué un champ électrique continu de 0,1 V à l'aide d'un générateur de fonctions (Rigol). La picoinjection a été réalisée pendant environ 1 h au cours de laquelle toutes les gouttelettes (injection et collecte) ont été conservées sur de la glace. Ensuite, l'émulsion a été maintenue à TA pendant 30 min puis incubée pendant 90 min à 42°C.

Des expériences d'échange de médicaments ont été réalisées comme les écrans de médicaments combinatoires décrits avec de petites adaptations : les différents médicaments n'ont été injectés qu'à partir de l'échantillonneur automatique, tandis que seuls les supports additionnés de BC-15 ou de BC-O et de DMSO ont été injectés en continu à partir de l'entrée braille, en utilisant une pompe à seringue normale au lieu de l'écran braille. Les émulsions de tous les échantillons ont été recueillies dans des puits individuels de plaques à 96 puits, incubées pendant 24 h à 37 ° C dans une atmosphère à 5 % de CO2, regroupées, puis traitées comme décrit pour les cribles de médicaments combinatoires.

Tout d'abord, 10 µl de BC-PCR et 5 µl de BC-RT, tous deux de 20 µM, ont été ajoutés aux puits respectifs d'une plaque à 96 puits, suivis de 4 µl de l'un des stocks de médicaments 50 fois correspondants d'Imatinib, Trametinib ou YM155 (tableau S4). Les cellules K562 ont été remises en suspension dans du milieu FS avec 1 % (poids/volume) de FBS à une concentration de 1050 cellules/µl. Pour chaque puits contenant le mélange de médicaments et de codes-barres, 181 µl de cette suspension cellulaire ont été ajoutés puis incubés à 37 °C dans une atmosphère à 5 % de CO2 pendant 12 h. Pour augmenter l'efficacité, la lyse et la ligature des cellules ont été effectuées en premier, suivies d'étapes de purification et de lavage, avant de procéder à la transcription inverse. En particulier, 20 µl de cellules ont été transférés dans un puits contenant 10 µl d'Igepal à 0,9 % (Sigma Aldrich), tampon de ligature 3x (NEB), 60 000 U/µl T4 Ligase (NEB) et 6000 U/µl NxGen RNase Inhibitor (Lucigen) pour la lyse cellulaire (10 min sur glace) et la ligature des codes-barres (30 min à température ambiante). Environ 200 ul de 6x SSC ont été ajoutés aux mélanges avant de les transférer dans des tubes Eppendorf de 1,5 ml pour une centrifugation à 2000 xg pendant 5 min. Les surnageants ont été transférés dans des tubes Eppendorf frais additionnés de 50 µl de dynabeads C1 à 10 µg µl-1 dans un tampon SSC 6x et incubés pendant 15 min à température ambiante sur un nutator (VWR). Les billes ont été lavées trois fois dans un tampon SSC 6x, brièvement centrifugées dans une centrifugeuse de paillasse, puis remises en suspension dans 80 µl de mélange de transcription inverse, contenant 1x tampon Maxima RT (Thermo Fisher), 4 % Ficoll-PM 400 (Sigma Aldrich), 1 mM dNTPs, 2000 U/µl NxGen RNase Inhibitor (Lucigen), 2,5 µM Template Switching Oligonucleotide (IDT) et 4 U/ul de transcriptase inverse Maxima-H (Thermo Fisher). Les mélanges ont été incubés sous nutation (VWR) pendant 30 min à température ambiante et pendant 90 min à 42 °C. Les billes ont été lavées deux fois dans du TE-SDS (10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA et 0,5% SDS) et deux fois dans de l'eau sans nucléase (Thermo Fisher) avant que l'ADNc de différentes conditions ne soit regroupé et traité pour les préparations de bibliothèque comme décrit dans la section "Préparation et séquençage de la bibliothèque".

Les cellules K562 ont été cultivées comme décrit dans la section "Préparation des suspensions cellulaires". Le jour des expériences, les cellules ont été lavées dans du PBS et remises en suspension dans du FreeStyle Media (Thermo Fisher)", additionné de 1 % de FBS. Pour comparer les stratégies de capture d'ARN basées sur Combi-seq et PolyA, 250 cellules/μl ont été transférées dans un tube Eppendorf et mélangées à une solution de 5 μl contenant les médicaments correspondants ou du DMSO, ainsi que des codes-barres Combi-Seq ou PolyA-Seq suspendus dans du FreeStyle Media, 1 % de FBS. 16 h d'incubation à 37 ° C et 5% d'atmosphère de CO2, les cellules ont été mélangées avec 15 μl de la solution contenant du tampon de lyse, de la ligase et de la transcriptase inverse comme dans l'expérience de gouttelettes (voir la section "Picoinjection pour la lyse cellulaire, la ligature des codes-barres et la transcription inverse" pour plus de détails).

Les pointes ERCC (Thermo Fisher, Cat No. 4456739) ont été diluées à 1:100 dans de l'eau sans RNase. Ensuite, 30 μl des ERCC enrichis dilués ont été ajoutés à un total de 600 μl du mélange réactionnel en un seul pot. Ce mélange réactionnel a été pico-injecté dans un rapport de 1: 3 à une gouttelette comme décrit dans la section "Picoinjection pour la lyse cellulaire, la ligature des codes à barres et la transcription inverse".

Lors de la transcription inverse de l'ARNm, tout l'ADNc a été codé selon les traitements médicamenteux et, par conséquent, nous avons rompu l'émulsion en ajoutant 0,5 à 1 ml de 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctanol (Abcr). Le surnageant a été transféré dans un tube Eppendorf frais, complété avec 1x le volume de dynabeads C1 (Thermo Fisher) à 2,5 µg µl-1 dans un tampon SSC 6x (Thermo Fisher) et incubé à température ambiante pendant 20 min. Les billes ont été lavées 2x dans du TE-SDS (10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA et 0,5% SDS) et 2x dans de l'eau sans nucléase (Thermo Fisher). Les billes ont été remises en suspension à 5 µg µl-1, suivies d'une digestion par Msel (NEB) conformément aux instructions du fabricant. Le surnageant a été purifié 2x à l'aide de billes SPRIselect (BD), d'abord à 0,6x puis à 0,8x le volume d'ADNc, et enfin amplifié dans un mélange prêt à l'emploi KAPA HiFi (Roche) avec 0,8 µM d'amorce SMART (tableau supplémentaire 3) sur un total de 13 cycles (programme PCR dans le tableau supplémentaire 4). Les produits ont été purifiés sur 0,6 fois le volume de billes SPRIselect, puis analysés à l'aide de puces à ADN haute sensibilité sur un bioanalyseur 2100 (Agilent). La fragmentation de l'ADNc a été effectuée pour raccourcir les fragments et introduire des séquences de liaison. Ceci a été réalisé en utilisant un protocole de tagmentation basé sur Tn5 pour les bibliothèques d'extrémité 3 'développées dans house41. Les fragments ont été amplifiés à l'aide d'une amorce P5-SMART (tableau supplémentaire 3) et d'amorces adaptatrices P7 indexées i7 (Illumina, tableau supplémentaire 3) à 0, 75 µM dans un mélange prêt à l'emploi KAPA HiFi (programme PCR, tableau supplémentaire 4). Les fragments ont été purifiés sur 1x le volume de billes SPRIselect et les distributions de taille ont été déterminées à l'aide d'un bioanalyseur. Tous les réplicats ont été regroupés à des rapports équimolaires et séquencés sur une machine NextSeq 500 (Illumina) avec 10 % de pointes PhiX. Le séquençage apparié a été effectué en séquençant la combinaison de codes à barres (lecture 1, 26 pb) à l'aide de l'amorce personnalisée de séquençage (tableau supplémentaire 3) et de l'ARNm (lecture 2, 59 pb).

Dans les boîtes à moustaches, la ligne centrale représente la médiane mesurée, et les charnières des boîtes supérieure et inférieure correspondent aux premier et troisième quartiles. Les moustaches s'étendant des charnières inférieure et supérieure de la boîte représentent la plage interquartile de 1,5 fois. Les points avec les lignes montrées dans le tracé du violon sur la Fig. 2d correspondent à la moyenne avec écart type pour chacune des contaminations croisées mesurées.

Nous avons utilisé le pipeline SCANPY42 pour le prétraitement de l'expression génique et le contrôle qualité. Les échantillons avec un faible nombre de gènes et un rapport élevé de gènes mitochondriaux (> 15 %) et des gènes avec un taux d'abandon élevé ont été filtrés. Le nombre de lectures a été normalisé en fonction de la profondeur de séquençage et du score z transformé. L'effet de lot (répliques) a été supprimé en utilisant la fonction de combat de SCANPY. Pour la réduction de dimension, nous avons utilisé l'analyse en composantes principales, suivie de l'incorporation de voisins stochastiques à distribution t (TSNE)43. Une analyse de données supplémentaire a été effectuée dans des scripts Python 3.7 personnalisés à l'aide de NumPy44 et de pandas en tant que bibliothèques statsmodels.

Pour analyser le regroupement des échantillons en fonction des différents facteurs (médicament de l'échantillonneur automatique, médicament des valves braille, combinaison), nous avons utilisé l'analyse du score de silhouette. Le coefficient de silhouette (b − a)/max(a,b) a été calculé pour chaque échantillon, où a était la moyenne intra- et b était la distance moyenne de la grappe la plus proche. Pour chaque facteur de regroupement, la moyenne des coefficients de silhouette a été calculée (bibliothèque Python scikit-learn). Comme le score de silhouette dépend du nombre de clusters, nous avons créé des clusters aléatoires en permutant les étiquettes d'échantillon, donc l'appartenance au cluster.

Les activités de la voie ont été calculées à l'aide de la méthode PROGENy17,18,19. Les activités de voie individuelles spécifiques au médicament ont été calculées en ajustant un modèle linéaire (pathway_activity ~ YM155 + Imatinib + Trametinib).

Pour comparer la similitude entre les signatures d'expression génique de l'écran à haut débit et l'ensemble de données LINCS-L10008, nous avons calculé les signatures consensuelles pour chaque médicament de l'écran à haut débit. Pour calculer les signatures consensuelles, nous avons ajusté un modèle linéaire (gene_expression ~ Drug1 + Drug2 + … + Drugn) pour chaque gène de la matrice d'expression et utilisé les coefficients du modèle linéaire comme signatures spécifiques au médicament. Pour comparer les similitudes de signature, nous avons calculé le coefficient de corrélation de rang de Spearman entre les signatures de médicament de l'écran à haut débit et les signatures LINCS-L1000. Les valeurs de similarité ont été utilisées comme valeurs prédites pour l'analyse ROC, tandis que les vrais positifs étaient les paires de médicaments appariées entre le criblage à haut débit et LINCS-L1000.

Pour les prédictions de viabilité cellulaire, nous avons utilisé la méthode CEVIChE. CEVIChE prédit la viabilité cellulaire à partir des changements d'expression génique sur la base d'un modèle linéaire, formé sur un grand nombre de données appariées sur la viabilité cellulaire et l'expression génique18. Comme les gènes mesurés de l'écran à haut débit montraient un faible chevauchement avec les gènes utilisés par le modèle CEVIChE original, nous avons recyclé CEVIChE en utilisant uniquement les gènes mesurés dans l'écran à haut débit. Ce modèle CEVIChE recyclé a montré des performances comparables (corrélation de Pearson entre la viabilité cellulaire prédite et observée : 0,31) à la méthode originale.

Des plaques de médicament ont été préparées à l'avance dans un damier 4 × 4 pour chaque combinaison, de sorte qu'après l'ajout de cellules, chaque médicament était présent à sa concentration en GR35 et une série de dilutions quadruple de celui-ci. Chaque plaque contenait également des milieux et des témoins négatifs DMSO et des monothérapies pour chaque médicament. Les cellules K562 ont été repiquées la veille de chaque expérience. Le jour de l'expérience, les cellules ont été lavées une fois avec du PBS, puis remises en suspension dans du milieu FreeStyle 293 (Thermo Fisher), contenant 1% de FBS. Les cellules ont été ajoutées à l'aide de la fonction multi-étapes d'une pipette multicanaux à chaque plaque de médicament pré-préparée, de sorte que chaque puits avait un volume final de 200 µL et ~ 2 × 104 cellules. Le réservoir à partir duquel aspirer les cellules était fréquemment rempli d'une solution mère fraîchement remise en suspension pour s'assurer que les cellules restaient en suspension. Les plaques ont été scellées avec une feuille perméable aux gaz (Sigma) et incubées pendant 48 h. Pour éviter l'évaporation, les plaques ont été conservées dans l'incubateur dans une boîte avec ~ 1 cm d'eau, à l'intérieur de la boîte, les plaques reposaient sur des boîtes à pointes. Après incubation, 22 µL de réactif de viabilité cellulaire PrestoBlue (Thermo Fisher) ont été ajoutés à chaque puits, et les plaques ont été refermées et remises dans l'incubateur pendant 1 h. Les plaques ont ensuite été lues à l'aide d'un lecteur de microplaques Tecan avec des longueurs d'onde d'excitation/émission de 535/615 nm (bande passante de longueur d'onde de 20 et 10 nm, respectivement). Sur la base de la viabilité cellulaire mesurée pour les monothérapies, nous avons calculé les viabilités cellulaires attendues à l'aide du modèle d'indépendance de Bliss24 pour chaque combinaison, pour chaque paire de concentration. La différence entre la viabilité cellulaire attendue et mesurée pour les combinaisons a été moyennée sur toutes les concentrations et a été donnée sous forme de score de synergie.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les données de séquençage d'ARN générées dans cette étude ont été déposées dans la base de données GEO sous le code d'accession GSE174696. Les données spectrométriques de fluorescence acquises sur les stations microfluidiques et les mesures de viabilité des cellules dans les plaques générées dans cette étude sont fournies dans le fichier Source Data. Les valeurs de logD des médicaments utilisés dans cette étude sont disponibles dans la base de données ChEMBL45. Les données sources sont fournies avec ce document.

Le logiciel de contrôle microfluidique peut être téléchargé sur www.epfl.ch/labs/lbmm/downloads. Les fichiers CAO des puces microfluidiques sont disponibles auprès de Zenodo : https://zenodo.org/record/6845607#.YtWZlMFBz1K. Le code utilisé pour analyser les données transcriptomiques peut être téléchargé à partir de https://github.com/saezlab/Combi-Seq-analysis46.

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Nous remercions tous les membres de la plateforme de génomique de l'EMBL pour leur aide dans la préparation des bibliothèques et le séquençage de nos échantillons, l'atelier électronique et mécanique de l'EMBL pour la construction de contrôleurs et de supports pour les valves Braille, le SIM EMBL pour la maintenance de l'aligneur de masque, Bart Deplancke et Cathrin Brisken pour leurs commentaires sur le manuscrit, et tous les membres actuels et précédents du laboratoire Merten pour les discussions et les commentaires. BS remercie le programme de bourses Premium de l'Académie hongroise des sciences (460044).

B. Szalaï

Adresse actuelle : Turbine Simulated Cell Technologies Ltd, Budapest, Hongrie

Ces auteurs ont contribué à parts égales : L. Mathur, B. Szalai.

Unité de biologie des génomes, Laboratoire européen de biologie moléculaire (EMBL), Heidelberg, Allemagne

Mathur L, Utharala R, Ballinger M, Landry JJM, Benes V et Merten CA

Collaboration pour un doctorat conjoint entre l'EMBL et l'Université de Heidelberg, Faculté des biosciences, Heidelberg, Allemagne

L. Mathur

Département de physiologie, Faculté de médecine, Université Semmelweis, Budapest, Hongrie

B. Szalaï

Institut d'enzymologie, Centre de recherche en sciences naturelles, Budapest, Hongrie

B. Szalaï

Institute of Bioengineering, School of Engineering, École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), Lausanne, Switzerland

NH You & CA Merten

Université de Strasbourg, CNRS, Architecture et Réactivité de l’ARN, UPR, 9002, Strasbourg, France

M. Ryckelynck

Faculté de médecine et hôpital universitaire de Heidelberg, Institut de biomédecine computationnelle, Université de Heidelberg, Heidelberg, Allemagne

J. Saez-Rodriguez

Faculté de médecine, Joint Research Center for Computational Biomedicine (JRC‐COMBINE), RWTH Aachen University, Aachen, Allemagne

J. Saez-Rodriguez

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LM a conceptualisé et développé la plate-forme microfluidique et l'approche de codage à barres, conçu et réalisé des expériences, et analysé les données sous la supervision de CAMBS, conçu et réalisé l'analyse informatique des données sous la supervision de JS-RNHD, conçu et réalisé des expériences et analysé les données. RU a écrit le logiciel LabVIEW utilisé pour la plateforme microfluidique. MB a réalisé des expériences de validation sur plaque. JJML a traité les données de séquençage sous la supervision de VBMR et a soutenu le développement des procédures de picoinjection. LM et BS ont interprété les résultats et rédigé le manuscrit avec l'aide de NHD, CAM et JS-R. revu et édité le manuscrit.

Correspondance à J. Saez-Rodriguez ou CA Merten.

LM, RU et CAM sont les inventeurs de demandes de brevet couvrant la stratégie de codage à barres et les méthodes microfluidiques décrites ici (WO2016207441A1). JS-R. a reçu des financements de GSK et de Sanofi et des honoraires de consultant de Travere Therapeutics et Astex Pharmaceuticals. BS est un employé à plein temps de Turbine Ltd., Budapest, Hongrie. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Jeremy Jenkins, Angela Wu et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail

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Réimpressions et autorisations

Mathur, L., Szalai, B., Du, NH et al. Combi-seq pour le profilage basé sur le transcriptome multiplexé de combinaisons de médicaments à l'aide de codes-barres déterministes dans des gouttelettes unicellulaires. Nat Commun 13, 4450 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32197-0

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Reçu : 26 mai 2021

Accepté : 21 juillet 2022

Publié: 01 août 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-32197-0

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