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Oct 27, 2023

Bioimpression 3D in situ avec bioink bioconcrete

Volume Communication Nature

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 3597 (2022) Citer cet article

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La bio-impression in situ est intéressante pour déposer directement la bioencre thérapeutique sur les organes défectueux afin de les réparer, en particulier pour les professions telles que les soldats, les athlètes et les conducteurs qui peuvent être blessés en cas d'urgence. Cependant, la bioencre traditionnelle affiche des limites évidentes dans ses environnements de fonctionnement complexes. Ici, nous concevons une bioencre bioconcrète avec des microgels chargés de cellules électropulvérisées comme agrégat et une solution de précurseur de méthacryloyle de gélatine (GelMA) comme ciment. Une imprimabilité prometteuse est garantie avec une large plage de températures bénéficiant des propriétés rhéologiques robustes de l'agrégat de microgel photoréticulé et de la fluidité du ciment GelMA. Les composants composites s'adaptent simultanément à la biocompatibilité et à différents microenvironnements mécaniques tissulaires. Une forte liaison à l'interface tissu-hydrogel est obtenue par des liaisons hydrogène et des frottements lorsque le ciment est photoréticulé. Cette bioencre possède une bonne portabilité et peut être facilement préparée en cas d'accident urgent. Pendant ce temps, les microgels peuvent être cultivés en mini-tissus, puis mélangés sous forme d'agrégats bioink, indiquant que notre bioconcret peut être fonctionnalisé plus rapidement que les bioinks normaux. Les résultats de la réparation des défauts crâniens vérifient la supériorité de cette bioencre et son potentiel dans les contextes cliniques requis pour le traitement in situ.

En tant que traitement émergent des anomalies organiques, la "bio-impression in-situ"1 initialement proposée par Campbell2. a capté l'attention de la clinique. En bref, la bio-encre thérapeutique est directement déposée sur les plaies des patients par des bio-imprimantes chirurgicales le long de trajets en fonction de leurs morphologies 3D3. Actuellement, il utilise principalement des méthodes similaires pour la bio-impression in vitro et a été appliqué dans les traitements de la peau, du cartilage et des os4. Par rapport à l'implantation d'organes basée sur la bio-impression 3D in vitro, elle présente plus d'avantages pour sa fonction de dépôt in situ (Note complémentaire 1).

Cependant, la bio-impression in situ est rudimentaire et a été limitée dans les applications cliniques. Outre le manque de bio-imprimantes in-situ fiables4, l'une des principales raisons est qu'il existe moins d'encre biologique adaptée répondant à ses exigences particulières. Dans les études pertinentes existantes, la bioencre appliquée est principalement similaire à celle de la bioimpression in vitro, à savoir la solution précurseur, qui n'est pas un choix prometteur pour la bioimpression in situ. (i) Dans la plupart des cas de bioimpression in situ, il n'y a pas de conditions pour contrôler strictement les propriétés rhéologiques de la bioencre, en particulier la bioencre thermosensible. (ii) Contrairement aux sous-sols de réception avec une surface propre et une température contrôlable sur les bio-imprimantes in vitro, la bio-impression in situ a un sous-sol de réception spécial, à savoir les plaies du patient avec une température constante (37 °C) et du sang, qui peuvent effondrer la structure imprimée avant la réticulation. (iii) Le bioink réticulé doit posséder un faible module mécanique pour que les cellules encapsulées exercent des fonctions thérapeutiques. (iv) Les structures doivent avoir des propriétés mécaniques élevées correspondant au défaut, se protégeant des dommages pendant la réparation, ce qui, cependant, conduit à une énorme contradiction avec l'exigence (iii). La construction de structures composites, c'est-à-dire l'impression d'échafaudages solides suivie de la coulée d'hydrogel souple, est devenue une solution efficace5,6,7,8. Cependant, un processus d'impression aussi complexe ne peut pas être réalisé en bio-impression in situ. (v) Une force de liaison forte doit être formée sur l'interface de structure imprimée par défaut. (vi) La bioencre in situ doit être portable et facilement préparée pour les professions telles que les soldats, les athlètes et les conducteurs qui peuvent être blessés en cas d'urgence.

Les microgels sont devenus des structures de bioimpression populaires dans la thérapie cellulaire9, la libération contrôlée de médicaments10, la modélisation de maladies11, etc., et de nombreuses méthodes de fabrication ont été proposées12,13,14,15,16. Récemment, outre l'unité fonctionnelle indépendante, dans la revue sur les microgels publiée dans Nature Reviews par Burdick et al. 17 en 2020, la large application de la "bioimpression secondaire"18,19,20,21 des microgels en tant que composant bioink à l'avenir a été prédite. Dans les derniers travaux d'Alge et al. 22 publiée dans Science Advances en 2021, une enquête approfondie sur le processus de dissipation des microgels lors de l'impression a été présentée. Wang et al. 9 microgels d'alginate injectés pour réparer un défaut d'organe de rat. Burdick et al. 23,24 microgels rassemblés extrudés pour établir des structures 3D spécifiques. Toutes les recherches ont bénéficié non seulement de la biocompatibilité prometteuse des microgels, mais également de leurs propriétés rhéologiques uniques similaires au fluide de Bingham25,26,27, qui se présente comme un élastomère en dessous d'un certain stress mais s'écoule comme un fluide de Newton une fois que le stress a été encore augmenté. Par conséquent, la bioencre à base de microgel a le potentiel d'être conçue comme une nouvelle bioencre de bioimpression clinique in situ pour s'adapter aux exigences complexes.

Dans ce travail, nous développons le bioink bioconcrete (A – C bioink) pour la bioimpression in situ, dont le nom vient du béton pour la construction et son abréviation vient des deux composants principaux : agrégat (A) et ciment (C) (Fig. 1, Vidéos supplémentaires 1 et et 2). Les microgels GelMA électropulvérisés (500 μm) sont utilisés comme composant principal (A) pour obtenir des propriétés rhéologiques robustes similaires au fluide de Bingham dans des environnements complexes (Notes complémentaires 3 et 4). La solution de précurseur GelMA (avec photoinitiateur) est utilisée comme composant auxiliaire (C) pour assurer la fluidité et l'imprimabilité. La structure composite photoréticulée possède une structure A/C avec un module mécanique faible/élevé, respectivement, ce qui résout parfaitement la contradiction entre le maintien de la biocompatibilité pour les cellules de thérapie chargées et le support de la contrainte de traction/compression élevée autour du défaut. De plus, le composant C peut facilement infiltrer la surface de la plaie et former une friction interne élevée et des liaisons hydrogène sur l'interface défaut-hydrogel après la photoréticulation. De manière pratique, cette bioencre est portable car le composant A/C peut être conservé dans de l'azote liquide, qui peut être décongelé avec des appareils de chauffage ou la température corporelle en cas d'accident. Pendant ce temps, les microgels peuvent être cultivés en mini-tissus avant le mélange, ce qui indique que notre bioink bioconcrete peut être fonctionnalisé plus rapidement que les traditionnels. Les résultats du traitement in situ des défauts crâniens du rat vérifient son potentiel en milieu clinique dans la bioimpression in situ à l'avenir.

Les panneaux supérieurs montrent les propriétés de la bioencre A – C proposée inspirée du béton pour la construction. Les panneaux inférieurs (I-VI) montrent l'utilisation de A – C bioink.

Le degré de substitution (DS) de GelMA peut être facilement modifié en modifiant les ratios de gélatine et d'acide méthacrylique. Une concentration plus élevée de DS et de solution précurseur entraîne des propriétés mécaniques plus élevées des structures photoréticulées28,29. Selon notre expérience, le GelMA à faible DS à 5 % (p/v) (EFL-GM-30) a de faibles propriétés mécaniques et une biocompatibilité élevée. Ainsi, il a été choisi d'électropulvériser des microgels GelMA (A30 / 5, 500 μm), dont il a été vérifié qu'ils possédaient des diamètres très uniformes (Note complémentaire 4 et Fig. 6 complémentaire). 20 % (w/v) High-DS GelMA (EFL-GM-300) peut supporter des contraintes de compression, telles que le tissu osseux, tandis que 20 % (w/v) Low-DS GelMA (EFL-GM-30) peut supporter des contraintes d'étirement, telles que le tissu tendineux. Ainsi, ils ont été sélectionnés comme composant C (C300/20, C30/20). À titre de comparaison, 5 % (p/v) de GelMA à faible DS (EFL-GM-30) a également été sélectionné comme composant C (C30/5).

Nous avons supposé que le composant C infiltrait exactement la lacune parmi le composant A afin que les microgels puissent générer suffisamment de frottement interne pour éviter l'effondrement avant la réticulation. L'A30 / 5 accumulé (avec GFP) dans le tamis cellulaire a été trempé à plusieurs reprises dans du C30 / 5 (avec RFP) et soulevé pour filtrer le C30 / 5 redondant (Fig. 2a). C30/5 est entré spontanément dans la vacance parmi A30/5 par capillarité. La bioencre A – C réticulée a montré que le composant A était étroitement lié l'un à l'autre (Fig. 2b, c). La proportion volumique du composant A a été analysée en zones rouges / vertes à 73,215 ± 2,312% (Note supplémentaire 2), ce qui était similaire à l'utilisation de l'espace atomique dans l'hexagone le plus compact (HCP) en chimie cristalline (74,05%) (Fig. 2d) en ce que le composant A présentait une forme sphéroïde standard sous flottaison et tension superficielle dans le composant C liquide et le système avait tendance à posséder la plus faible énergie sous gravité.

un croquis de la méthode de mouillage dans l'expérience d'analyse de proportion de volume. b Morphologie optique de la structure composite A–C. c Morphologie fluorescente de la structure composite A – C (Zen, Carl Zeiss, version 8,0,0,273). d Treillis de paquet de placard hexagonal en chimie du cristal. e Les pièces du kit A–C bioink. f–k Les étapes de préparation de la bioencre portable A–C. Pour b, c, chaque expérience a été répétée indépendamment avec des résultats similaires 3 fois.

Un sac d'urgence a été conçu pour répondre aux exigences de stockage et de portabilité (Fig. 2e). Un composant de chargement des cellules a été immergé dans un milieu de cryoconservation et stocké dans un tube de congélation comme décrit précédemment par Ouyang et al. 30. Le composant C a également été stocké dans un autre tube de congélation. Les proportions volumiques du composant A/C dans un kit étaient de 74,05 %/25,95 %, respectivement. Les deux tubes de congélation ont été stockés dans un récipient rempli d'azote liquide.

Lors d'un accident, les tubes de congélation ont été retirés du conteneur et décongelés avec un petit coussin chauffant à 37 ° C alimenté par une batterie USB portable (Fig. 2f). Pour les accidents très urgents sans appareils de chauffage, ils pourraient être directement chauffés à l'aide de la température corporelle. Certes, la blessure par le froid sur la peau du patient doit être remarquée. Ensuite, le milieu de cryoconservation a été retiré par une seringue et une serviette. Un composant a été transféré au composant C avec une fine cuillère et agité uniformément, suivi d'un transfert de bioencre A – C dans une nouvelle seringue avec une buse d'impression conique pour la bioimpression in situ avec des bioimprimantes in situ professionnelles ou simplement des mains, suivi d'une photoréticulation avec une lampe de poche bleue de 405 nm, qui s'est avérée sûre et largement utilisée dans les scènes cliniques actuelles, telles que la photopolymérisation des dents, le traitement à la lumière bleue de la jaunisse néonatale, etc.

En pratique, le volume total de bioink est déterminé par les volumes et les quantités des tubes de congélation appliqués. À la fin de la production de la bioencre A–C, la bioencre A–C préparée peut être chargée avec différents types de tubes de congélation en fonction des exigences de production. De plus, du côté du sauvetage, en termes de quantités de tubes de congélation, les sauveteurs peuvent certainement prendre autant de tubes de congélation chargeant A – C bioink que possible en fonction de la situation de blessure du patient. Par conséquent, avec le développement et la production de masse de la bioencre A – C, ce système de bioencre serait réalisable pour la bioimpression in situ de défauts tissulaires aussi grands que possible.

A–C bioink doit posséder une robustesse rhéologique élevée dans différentes conditions de température pour s'adapter aux différentes situations accidentelles de traitement in situ. A30/5–C30/20, A30/5–C300/20, A30/5–C30/5 et C bioink C30/20, C300/20, C30/5 ont été préparés. 4, 24 et 37 ° C ont été sélectionnés, sous lesquels la solution de précurseur GelMA serait en gélification excessive, sol-gel optimisé et état de solisation excessif pour l'extrusion de la bio-impression, respectivement31,32.

Les résultats du balayage de flux ont indiqué que les bioencres A – C et C présentaient une fonction d'amincissement par cisaillement sous les trois températures sélectionnées (Fig. 3c), répondant à l'exigence de base de la bioimpression par extrusion. En effet, les microgels GelMA étaient séparés les uns des autres et la friction entre eux disparaissait à un taux de cisaillement élevé. De plus, l'orientation des molécules discrètes de GelMA dans le composant C avait tendance à coïncider et le jumelage des molécules était réduit (Fig. 3a). Selon des études publiées9,33, le système principalement composé de microgels avait des propriétés fluides de Bingham. Les données de balayage de flux des bioinks A – C ont été en outre adaptées au modèle de fluide de Bingham comme suit :

dans laquelle \(\sigma\), \({\sigma }_{\rm {{y}}}\), \({\eta }_{{\rm {B}}}\) et \(\dot{\gamma }\) est la contrainte, la limite d'élasticité, la viscosité Bingham, le taux de cisaillement, respectivement. Toutes les bioencres A – C présentaient une caractéristique de fluide de Bingham et une relation linéaire entre la contrainte et le taux de cisaillement au-dessus d'une certaine contrainte (Fig. 3d, e). La limite d'élasticité a augmenté à 4 ° C en raison de la gélification excessive du composant C au cours de laquelle les molécules de GelMA formeraient successivement un spirochète de type collagène, un agrégat de spirochètes et un réseau d'agrégats (Fig. 3b). La caractéristique solide/fluide au-dessous/au-dessus de la limite d'élasticité était due au frottement interne entre le composant A et la malposition des microgels au-delà du frottement statique, respectivement.

a Le mécanisme de la fonction d'amincissement par cisaillement de A – C bioink. b Le mécanisme du transfert sol-gel de la solution précurseur de GelMA. c Test de balayage de flux. d Ajustement avec le modèle de fluide Bingham. e Limite d'élasticité. (n = 3 expériences indépendantes. Les données sont présentées sous forme de valeur moyenne ± SD.) f Test de fréquence d'oscillation. g Test de thixotropie. h Essai de rampe de température départ recyclé.

Bioink doit posséder une fluidité pour former des filaments à partir de buses et afficher une caractéristique solide pour maintenir la forme. Les résultats des tests de fréquence d'oscillation ont montré que tous les bioinks A – C sous différentes températures possédaient une caractéristique solide / fluide sous basse / haute fréquence, respectivement, bénéficiant de la propriété fluide de Bingham (Fig. 3f). Remarquablement, la bioencre GelMA monocomposant traditionnelle serait transférée à la solisation et ne peut pas conserver sa forme à la température du corps (37 ° C). Cependant, même en dessous de 37 ° C, la bioencre A – C présentait toujours un état solide à basse fréquence, vérifiant sa faisabilité pour se déposer sur les plaies. Les résultats de thixotropie en ajoutant des amplitudes d'oscillation périodiquement variées (200% et 1%) indiquant que le transfert d'état de la bioencre A – C était rapide et évidente, confirmant sa vitesse d'auto-guérison rapide. (Fig. 3g)

Les bioencres thermosensibles ont besoin de temps pour atteindre un état stable sous une certaine température. De plus, pour une certaine température, l'état sol-gel à un certain moment serait affecté par l'état précédent et totalement différent au cours du processus d'augmentation/diminution de la température. Des tests de rampe de température d'écoulement de bioink A – C et C ont été effectués pour examiner la variation de viscosité à des températures croissantes / décroissantes répétées (4–39 ° C, 5 ° C / min) trois fois (I – III) (Fig. 3h). Les résultats ont montré que même les courbes de viscosité du processus d'augmentation/diminution de la température de la même bio-encre n'étaient pas superposées, vérifiant la réversibilité et la stabilité de l'état médiocre de la bio-encre thermosensible. Cependant, par rapport à C bioink, les zones entourées par les courbes de viscosité dans les trois tests continus de A – C bioink étaient presque superposées, indiquant que A – C bioink pouvait efficacement éviter l'effet de l'état précédent. De plus, pour une plage de changement de température aussi large, la viscosité de C bioink s'est étendue de 4 à 5 magnitudes, tandis que celle de A – C bioink s'est maintenue à l'intérieur de 1 magnitude en raison du rôle dominant des microgels. Remarquablement, des températures de bioimpression prometteuses de 20 à 24 ° C étaient également la plage de changement de viscosité spectaculaire. On pourrait imaginer qu'une fois qu'une minuscule température flottant dans cette plage s'est produite lors de la bio-impression in situ, la viscosité de la bio-encre traditionnelle varierait fortement et entraînerait un risque imprévisible, tandis que la bio-encre A – C peut parfaitement maintenir la stabilité de la viscosité dans une large mesure et garantir la validité du traitement.

Une scène de bioimpression simulée in situ a été établie pour évaluer l'imprimabilité de la bioencre A – C à partir des états d'extrusion et de dépôt. Pour l'état d'extrusion, trois températures ambiantes (4, 24, 37 °C) et A30/5–C300/20 et C300/20 ont été sélectionnées et extrudées à un débit constant. (Fig. 4a). À 37 ° C, C bioink était dans un état de solisation excessif et formait des gouttelettes. À 4 ° C, C bioink était dans un état de gélification excessif et était devenu une masse d'hydrogel dans la seringue, formant par intermittence un fragment. C bioink a montré une bonne imprimabilité uniquement à 24 ° C et a formé des filaments uniformes. Cependant, la bioencre A – C, grâce à sa grande robustesse rhéologique, pourrait former des filaments uniformes aux trois températures. Pour l'état de dépôt, la température ambiante a été fixée à 24 °C pour obtenir le meilleur état d'extrusion. Pour simuler les plaies des patients, la plate-forme de réception a été réglée à 37 ° C (température corporelle) et une solution de colorant alimentaire (sang) a été enduite (Fig. 4b). La bioencre A – C déposée pouvait parfaitement maintenir la structure 3D tandis que la bioencre C fondait progressivement et se mélangeait au «sang». Ainsi, A – C bioink montrerait une grande adaptation aux conditions complexes autour des plaies. De plus, A – C bioink a été imprimé avec succès avec une bio-imprimante 3D commerciale pour établir un cube 3D avec 12 couches et une hauteur de 7,5 mm dans la température ambiante à peu près contrôlée (30 ° C) et sur le sous-sol de réception "enroulé". (Fig. 4c, notes supplémentaires 5, 9 et vidéo supplémentaire 3).

a Le filament extrudé se forme à différentes températures. b Maintien de la forme au niveau de la « plaie » remplie de « sang » à 37 °C. c Impression 3D d'un cube à "plaie" rempli de "sang" à 37 ° C avec A – C bioink. d Mécanisme de formation de la force de liaison stable. e Frottement interne sur l'interface. f Liaisons hydrogène entre les groupes amino sur les tissus et les groupes aldéhyde photo-générés sur GelMA. g Test de liaison à la traction avec A–C bioink et tendon de porc. h Test d'effort contraignant de A30/5–C30/20 avec tendon de porc. i Test de liaison compressive avec A–C bioink et côte de porc. j Test d'effort contraignant de A30/5–C300/20 avec côte de porc.

Dans la bio-impression in vitro, les structures 3D sont réticulées sur la plate-forme de dépôt, ce qui entraîne un manque de force de liaison forte avec les tissus après la transplantation. Pendant le traitement, le déplacement des structures transplantées peut être invalide ou dangereux pour les patients. En revanche, la bioencre A – C déposée in situ formerait une forte force de liaison sur l'interface défaut / hydrogel (Fig. 4d). En effet, le composant C peut afficher une fluidité après avoir été en contact avec la température corporelle et s'infiltrer facilement dans la lacune du défaut, augmentant les sites de fixation sur l'interface et le frottement interne (Fig. 4e). De plus, sur la base des propriétés chimiques spéciales de GelMA, les structures composites A – C peuvent créer une force d'interface auxiliaire sur la plaie, ce qui était probablement dû aux groupes aldéhydes photo-générés se liant aux groupes amino à la surface des tissus34 (Fig. 4f). Pour observer distinctement la forte force de liaison, la bioencre A30 / 5 – C30 / 20 a été versée sur du tendon de porc frais (Fig. 4g), tandis que la bioencre A30 / 5 – C300 / 20 a été versée sur une côte de porc fraîche (Fig. 4i). Des forces dans toutes les directions ont été ajoutées aux structures A – C (vidéo supplémentaire 4). Structures A–C fortement attachées à la surface des tissus. Pour explorer la force de liaison entre A – C bioink et la surface des tissus, A30 / 5 – C30 / 20 et A30 / 5 – C300 / 20 ont été coulés (environ 2 mm de hauteur) et photoréticulés entre deux morceaux de tendon de porc frais (la section transversale était d'environ 3 cm × 1 cm) et deux morceaux de côtes de porc fraîches (la section transversale était d'environ ⌀ 1, 6 cm), respectivement. La contrainte de liaison a été testée par la méthode d'étirement de la structure tissu-hydrogel-tissu en coupant deux morceaux de tissu dans la direction opposée à 1 mm/min. La contrainte de liaison entre A30/5–C30/20 et le tendon de porc pourrait atteindre plus de 4000 Pa (Fig. 4h) et celle entre A30/5–C300/20 et la côte de porc pourrait atteindre près de 6000 Pa (Fig. 4j). Deux étapes se sont produites sur A30/5–C300/20 et la courbe des nervures car A30/5–C300/20 était plus adaptée à la compression et formerait une fissure lors du test d'étirement. Tous les résultats ont indiqué que A – C bioink répondrait à l'exigence d'une forte force de liaison.

Par rapport à la méthode traditionnelle d'établissement de structures composites, à savoir l'impression d'échafaudages renforcés suivie d'un coulage d'hydrogel doux, la méthode basée sur la bioencre A – C présente une supériorité évidente. Premièrement, la conception de la structure peut être plus flexible et renforcer le réseau d'échafaudage qui se formerait spontanément autour d'un composant. De plus, étant donné que les composants A / C sont tous deux des GelMA possédant des doubles liaisons carbone-carbone, lors de la photoréticulation, les doubles liaisons carbone-carbone n'ayant pas réagi à la surface des microgels GelMA en électropulvérisation se briseraient et se connecteraient à celles cassées dans le composant C, formant de fortes liaisons covalentes sur l'interface A / C (Fig. 5a), qui est absente des méthodes traditionnelles.

a Mécanisme du processus de formation de liaisons covalentes stables de la structure composite A – C. b Courbe d'essai de traction. c État de traction de différents bioink. d Courbe d'essai en compression. e État de compression de différents bioink. f Modèles de simulation de la structure composite A–C en traction/compression et de la cellule unitaire. g Simulation compressive de la structure composite A–C. h Simulation de traction d'une structure composite A–C.

Les propriétés de compression de A30/5–C300/20, C300/20, A30/5–C30/5, C30/5 et les propriétés de traction de A30/5–C30/20, C30/20, A30/5–C30/5, C30/5 ont été testées. Le module de compression était de 204,00, 2608,00, 16,26 et 3,73 kPa, respectivement (Fig. 5b) et le module de Young était de 1,81, 11,98, 0,80 et 1,26 kPa, respectivement (Fig. 5d), indiquant que le composant C renforçait manifestement les propriétés mécaniques de la structure imprimée, ce qui a également été prouvé par l'observation visuelle (Fig. 5c– e).

La distribution des contraintes à l'intérieur de la structure composite A–C a été analysée par simulation par éléments finis. La structure a été simplifiée en tant que modèle HCP (Fig. 5f). La condition aux limites de déplacement dans le modèle de traction/compression a été fixée à 50 %/10 %, respectivement (Fig. 5g, h). Par rapport à la structure C, une contrainte de Von Mises élevée est répartie entre les microgels dans la structure composite A – C, tout comme un échafaudage solide "imprimé" à l'intérieur, ce qui a permis de fournir une matrice extracellulaire (ECM) avec un environnement mécanique similaire dans différents types de bioencre A – C. Par analogie avec la méthode de recherche sur les cellules unitaires en chimie cristalline, nous avons mis en place de manière innovante le concept de "cellule unitaire A – C" avec la même méthode d'incision que HCP, affichant un réseau régulier à haute contrainte emballé les microgels à faible contrainte à l'intérieur à la fois dans les modèles de compression/traction.

Des cellules stromales de moelle osseuse encapsulées A30 / 5 (BMSC) ont été électropulvérisées et cultivées pour être utilisées ultérieurement comme unités de thérapie cellulaire fonctionnelle dans A – C bioink. La viabilité cellulaire aux 1er, 4e et 7e jours s'est avérée supérieure à 90 % avec le kit LIVE/DEAD (Fig. 6a), indiquant que la biocompatibilité de base de la morphologie A30/5 et F-actine a montré que les BMSC pouvaient se propager progressivement à l'intérieur du microenvironnement 3D (Fig. 6b). En outre, certains BMSC encapsulant A30/5 ont été cultivés dans un milieu d'induction ostéogénique après une culture de base de trois jours. Au 7ème jour d'induction, A30 / 5 a été coloré avec de la phosphatase alcaline (ALP) et a montré que les BMSC induits étaient entrés dans le stade ostéogénique précoce (Fig. 6c). Au 21e jour de l'induction, A30 / 5 a été coloré avec du rouge d'alizarine S (ARS) et a montré que les BMSC induits étaient entrés dans le stade ostéogénique tardif et produisaient des nodules de calcium à l'intérieur de l'A30 / 5 (Fig. 6d), ce qui a vérifié sa capacité de différenciation ostéogénique et son effet thérapeutique potentiel. De plus, A30 / 5 avec BMSC subirait une force de cisaillement de la buse d'impression lors de l'impression in situ, ce qui pourrait provoquer une apoptose cellulaire. D'après les résultats des tests d'apoptose avec cytométrie en flux (Fig. 6e), l'apoptose causée par l'extrusion n'était pas évidente, démontrant que l'environnement mou formé par A30 / 5 pouvait protéger les BMSC encapsulés de la force de cisaillement lors de l'extrusion et garantir la fonction biologique.

a Viabilité des BMSC encapsulés dans des microgels GelMA. b Morphologie de l'actine des BMSC encapsulées dans des microgels GelMA. c Test ALP du composant A chargé de BMSC ostéogéniquement induit. d Test ARS du composant A chargé de BMSC ostéogéniquement induit. e Test d'apoptose avec l'annexine V-FITC/PI par cytométrie en flux. Pour a–d, chaque expérience a été répétée indépendamment avec des résultats similaires 3 fois.

Pour examiner l'action thérapeutique de la bioencre A – C, une bioencre A30 / 5 – C300 / 20 avec ou sans BMSC a été déposée directement à l'intérieur du défaut crânien du rat (colonne: diamètre 5 mm et hauteur 1, 5 mm) et photoréticulée (Fig. 7a). À la 2e semaine, la tomodensitométrie a révélé une nouvelle formation osseuse dans le groupe A – C chargé de BMSC (Fig. 7c). Cependant, aucun nouvel os évident ne s'est formé dans le groupe vierge, et le groupe sans charge BMSC a montré une quantité très limitée de régénération osseuse. C'était probablement parce que les hydrogels agissaient comme un échafaudage pour les cellules pertinentes sur l'emplacement du défaut d'origine et fournissaient plus d'espace de croissance. De plus, le groupe A – C chargé de BMSC présentait une meilleure efficacité de régénération osseuse avec un BV / TV plus élevé (Fig. 7b). À la 4ème semaine, l'os a presque complètement ponté le site lésé dans le groupe A – C chargé de BMSC, et le groupe non chargé de BMSC a également présenté une nouvelle croissance de tissu osseux. Les valeurs BV / TV ont augmenté avec le temps dans tous les groupes et les groupes chargés et déchargés de BMSC étaient significativement plus élevés que ceux du groupe vierge. Conformément à l'examen radiographique, l'analyse histologique avec l'hématoxyline et l'éosine (Fig. 7d) et la coloration au trichrome de Masson (Fig. 7e) à la 2e semaine ont révélé une nouvelle formation osseuse avec la plus grande surface dans l'échantillon du groupe chargé de BMSC, et aucune formation osseuse marquée dans les groupes vierges et non chargés de BMSC. À la 4ème semaine, la formation osseuse a augmenté dans tous les groupes. Les observations histologiques à des grossissements plus élevés ont confirmé que l'os néoformé avec une structure typique dans le groupe chargé de BMSC présentait beaucoup plus de régions de nouvelle formation osseuse mature que les autres groupes, indiquant que la bioencre AC chargée de BMSC pouvait favoriser la formation osseuse endogène dans un modèle de défaut crânien de rat de taille critique.

a Implantation et photoréticulation de A – C bioink dans un modèle de défaut crânien de rat. b Valeur BV/TV. (n = 5 rats. Les données sont présentées sous forme de valeur moyenne ± SD avec GraphPad Prism 8.) Une ANOVA bilatérale à deux voies suivie d'un test de comparaisons multiples post hoc de Tukey a été utilisée. Et le test statistique a été effectué dans les groupes 2w ou 4w, respectivement, mais pas dans les groupes 2w et 4w. c Examen de tomodensitométrie. d Analyse histologique avec coloration H&E. e Analyse histologique avec coloration au trichrome de Masson. Pour d, e, chaque expérience a été répétée indépendamment avec des résultats similaires 3 fois.

Les cas cliniques réels de défaut d'organe sont causés par toutes sortes d'accidents, tels que les incendies, les accidents de la circulation et les blessures militaires. Ainsi, les morphologies 3D et les tailles des défauts d'organes sont très différentes. Pour examiner la capacité de bio-impression in situ de A – C bioink dans un cadre clinique, quatre "patients" de rat présentant des malformations crâniennes de formes approximativement rectangulaires, carrées, trapézoïdales et triangulaires (hauteur de 1, 5 mm) ont été créés avec un trépan dentaire (Fig. 8a – c). Le système de bras robotique a été sélectionné comme outil de bio-impression in situ (Fig. 8b). Quatre "patients" rats ont été placés sur la table d'opération. Les modèles 3D des défauts ont été reconstruits avec un logiciel de conception assistée par ordinateur, et le programme de routine d'impression a été généré avec un logiciel de tranchage et chargé dans le système de contrôle du bras robotique. Des BMSC encapsulées dans une bioencre A30 / 5 – C300 / 20 ont été déposées in situ dans le défaut crânien de quatre "patients" et photoréticulées avec une lumière bleue à 405 nm (Vidéo supplémentaire 5). Après 6 semaines d'implantation, la tomodensitométrie a révélé qu'un nouvel os s'était formé du bord vers le centre des défauts chez tous les "patients" (Fig. 8d, e), ce qui a vérifié la haute faisabilité de la bioencre A – C dans la thérapie de bioimpression in situ.

une structure 3D morphologies des modèles de défaut crânien de rat. b Étapes de bio-impression in situ avec A – C bioink. c Morphologie originale du défaut crânien du "patient". d Examen tomodensitométrique après 6 semaines de traitement in situ. e Valeur BV/TV après 6 semaines de traitement in situ.

La plupart des études actuelles sur la bioencre à base de microgel n'ont déposé que des microgels rassemblés in vitro/vivo pour former des structures 3D, qui peuvent s'effondrer ou être expulsées du site de la plaie par voie hypodermique avec les activités quotidiennes des patients. Pendant tout ce temps, les excellentes caractéristiques et la révolution de la bioencre à base de microgel ont été ignorées dans la bioimpression in situ. La bioencre bioconcrète proposée ici contenait un composant de ciment à la demande, à savoir une solution de précurseur d'hydrogel différente dans le système bioink, et l'interaction entre l'agrégat et le composant de ciment a résolu avec succès les problèmes qui ont été limités dans le développement de la bioimpression clinique in situ. En combinant les propriétés rhéologiques prometteuses des microgels et l'adaptabilité mécanique de GelMA, A – C bioink a affiché une bonne robustesse d'impression in situ, la simplicité de l'établissement de la structure composite, l'action thérapeutique in vivo, la force de liaison sur l'interface tissu/hydrogel et la portabilité.

Jusqu'à présent, de plus en plus de méthodes de fabrication de microtissus fonctionnels ont été proposées. En outre, le composant A chargé de cellules peut être facilement pré-induit avec un milieu d'induction spécifique et stocké dans de l'azote liquide pour une meilleure portabilité et un meilleur effet thérapeutique, permettant de réaliser la production et le transport de masse de bioink A – C pour répondre aux exigences cliniques. Nous pensons que A – C bioink jouera un rôle important dans le traitement des défauts d'organes et fera un grand effort pour développer une technologie de bio-impression clinique in situ.

À l'avenir, A–C bioink pourra être conçu de plusieurs manières. Pour le composant A, les espèces de cellules dans le composant A peuvent être modifiées pour plus de fonctions (Note complémentaire 7). En outre, des microgels hiérarchiques ont été fabriqués dans notre étude précédente35, avec lesquels des actions de traitement synergiques ont pu être réalisées. Pour le composant C, GelMA est le seul biomatériau appliqué ici et d'autres biomatériaux pourraient être des substituts tels que l'acide hyaluronique méthacryloyle (HAMA) avec une grande capacité de réglage mécanique36,37,38,39,40. De plus, lors de l'exploration, nous avons découvert que le composant A encapsulant les cellules endothéliales pouvait être vascularisé par le composant C encapsulant les cellules tumorales sécrétant le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF)41,42 (Note supplémentaire 8), ce qui réaliserait probablement une vascularisation in situ sur les défauts d'organes. De plus, le problème de fourniture de nutrition/gaz dans la structure d'hydrogel à grande échelle est un problème courant dans la bio-impression in situ ou la bio-impression in vitro. Heureusement, des chercheurs de notre laboratoire43 ou d'autres laboratoires44 ont proposé une série de moyens efficaces pour résoudre ce problème. Par conséquent, à l'avenir, la bioencre A – C de nouvelle génération pourrait être conçue comme celle avec un composant sacrifié ou un composant de séparation de phases pour former davantage de réseau nutritionnel dans la structure A – C.

Compte tenu de la portabilité et de la faisabilité multi-scènes, nous appelons au développement d'équipements intelligents et portables pour la bio-impression in situ A – C bioink à l'avenir. En tant qu'hypothèse, un dispositif de chauffage intégré à une bouteille composée, une batterie portable et une lampe de poche pourraient être conçus. En outre, du point de vue du développement urbain, des «stations d'azote» comme les stations-service et des «bio-imprimantes in-situ portatives partagées» comme les vélos partagés peuvent être établies dans des positions publiques en tant que service social, de sorte que le stockage à long terme de la bioencre A – C dans les longs trajets et l'immédiateté de la bio-impression in-situ peuvent être garantis.

Une solution de prépolymère GelMA pure à 5 % (p/v) a été préparée en dissolvant le GelMA lyophilisé (EFL-GM-30, pureté > 99,9 %) et le phényl-2, 4, 6-triméthylbenzoylphosphinate de lithium (LAP, 0,5 % (p/v), pureté > 99,8 %) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). La solution a été filtrée à travers un filtre de 0,22 µm. Un champ électrique a été formé avec la buse métallique (30 G) et l'anneau métallique. Le débit de l'encre d'électropulvérisation a été fixé à 50 μL/min et entraîné par une pompe à injection. La tension a été fixée à 2,86 kV. La température ambiante a été fixée à 30°C pour assurer la fluidité appropriée de l'encre d'électropulvérisation. Les microgouttelettes électropulvérisées ont été reçues par une boîte de Pétri remplie d'huile de silicone et réticulées par une lumière bleue à 405 nm. Les microgels GelMA réticulés ont été transférés dans un tube centrifuge et centrifugés à 128,57 x g pendant 5 min (3 fois) pour éliminer l'huile de silicone. Les microgels ont été stockés dans du PBS. Pour les microgels GelMA chargés de BMSC, les BMSC ont été mélangés dans l'encre d'électropulvérisation à une densité cellulaire de 5 × 105 cellules/ml. Les microgels GelMA chargés de BMSC préparés ont été cultivés dans un milieu complet DMEM/F-12 additionné de 10 % (v/v) de sérum bovin fœtal (FBS) à 37 °C et 5 % de CO2.

La solution de prépolymère GelMA pur a été préparée en dissolvant le GelMA lyophilisé (EFL-GM-30/EFL-GM-300, pureté > 99,9 %) et le phényl-2, 4, 6-triméthylbenzoylphosphinate de lithium (LAP, 0,5 % (p/v)) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). La solution a été filtrée à travers un filtre de 0,22 µm.

Pour les tests rhéologiques de la bioencre A – C, un rotor à plaques parallèles de 25 mm a été sélectionné et l'espace de test a été défini sur 2, 5 mm (environ 5 fois le diamètre du composant A). Pour les tests rhéologiques de C bioink, un rotor à plaques parallèles de 25 mm et un espace de test de 1 mm ont été définis dans le test à 4 ° C et un rotor à plaques parallèles de 50 mm et un espace de test de 0,5 mm ont été définis dans les tests à 24 et 37 ° C. Pour les tests de balayage de flux, la plage de taux de cisaillement a été définie entre 0,1 et 100 s-1. L'ajustement des données avec le modèle fluide de Bingham a été réalisé avec MATLAB. Pour les tests de fréquence d'oscillation, l'amplitude a été fixée à 1 % et la plage de fréquences a été fixée à 1 000–0,1 rad/s. Pour les tests de thixotropie, l'amplitude d'oscillation variée périodiquement (200 % et 1 %) a été ajoutée aux échantillons. La période d'alternance a été fixée à 30 s et cinq points ont été examinés à chaque étape et répétés trois fois. Pour les tests de rampe de température d'écoulement, la bio-encre a subi un refroidissement/chauffage trois fois dans les deux sens. La vitesse de changement de température a été fixée à 5 °C/min.

Pour les échantillons compressifs, la bioencre A30/5-C300/20, C300/20, A30/5-C30/5 et C30/5 a été versée dans le moule cylindrique (φ9 mm × 6,3 mm) et réticulée avec une lumière bleue de 405 nm. Pour les échantillons de traction, A30/5–C30/20, C30/20, A30/5–C30/5 et C30/5 bioink ont ​​été versés dans le moule cuboïde (20 mm × 3 mm × 5 mm). Le test mécanique a été effectué sur une machine de test d'échantillons d'hydrogel. La vitesse de déplacement a été fixée à 1 mm/min. La simulation mécanique a été exécutée avec COMSOL Multiphysics. Les coefficients de Poisson des structures C30/20 et C30/5 ont été fixés respectivement à 0,034 et 0,031. La condition aux limites de déplacement dans la simulation de traction a été fixée à 50 % de la longueur d'origine du modèle. Les coefficients de Poisson des structures C300/20 et C30/5 ont été fixés respectivement à 0,218 et 0,031. La condition aux limites de déplacement dans la simulation de compression a été fixée à 10 % de la longueur d'origine du modèle.

Les BMSC (cellules primaires de rats) ont été fournies par Stomatology Hospital, School of Stomatology, Zhejiang University School of Medicine, Zhejiang Provincial Clinical Research Center for Oral Diseases, Key Laboratory of Oral Biomedical Research of Zhejiang Province, Cancer Center of Zhejiang University, Hangzhou 310006. Les microgels GelMA électropulvérisés chargés de BMSC ont été cultivés dans un milieu complet DMEM/F-12. La viabilité des BMSC a été mesurée après 1, 4 et 7 jours. La viabilité cellulaire a été testée avec le test Live/Dead pendant 40 min. Par la suite, le CLSM a été appliqué pour imager les BMSC encapsulés en obtenant deux images de chaque image : verte pour les cellules vivantes et rouge pour les cellules mortes. Les nombres de cellules vivantes et mortes ont été analysés avec ImageJ, et la viabilité BMSC a été calculée comme le rapport du nombre de cellules vivantes au nombre total de cellules. Pour la morphologie des BMSC encapsulés, ils ont été colorés avec un colorant cytosquelettique, y compris l'actine qui a été colorée avec de la phalloïdine TRIC (40734ES75, Yeasen Biotechnology), et le noyau a été coloré avec du DAPI. Le composant A chargé de BMSC a été imagé avec CLSM.

Les microgels GelMA chargés de BMSC électropulvérisés ont été cultivés dans un milieu complet DMEM / F-12 pendant 3 jours. Par la suite, un milieu d'induction ostéogénique DMEM / F-12 a été préparé avec de la dexaméthasone (0, 1 mM), du phosphate de β-glycérol disodique hydraté (10 mM) et de l'acide l-ascorbique (50 μg / ml). Les microgels GelMA chargés de BMSC ont été induits avec le milieu d'induction préparé. Le 7ème jour, le composant A chargé de BMSC a été fixé avec du polyformaldéhyde à 4 % (p/v) pendant 30 min et coloré avec de la phosphatase alcaline (ALP). Le 21e jour, le composant A chargé de BMSC a été fixé avec du polyformaldéhyde à 4 % (p/v) pendant 30 min et coloré avec du rouge d'alizarine S. Les échantillons colorés ont été observés au microscope optique.

Les A30 / 5 avec BMSC ont été électropulvérisés comme ci-dessus, dont la moitié a été extrudée à partir d'une buse en forme de cône de 20 G à 150 μL / min. Après 4 h de culture, l'A30/5 extrudé et non extrudé avec les BMSC a été dégradé avec une solution de PBS de collagénase II à 20 U/mL pendant 30 min (37 °C) pour éliminer l'hydrogel GelMA. Les cellules récoltées ont été colorées avec des kits Annexin V-FITC/PI et testées par cytométrie en flux, respectivement. Les données ont été analysées avec le logiciel FlowJo.

Trente rats SD mâles âgés de 12 semaines (250 à 300 g) ont été fournis par le Centre d'expérimentation animale de l'Université du Zhejiang (Hangzhou, Chine). Les expériences ont été approuvées par le Comité d'éthique pour la recherche animale de l'Université du Zhejiang (numéro d'approbation éthique : ZJU20210172) et réalisées conformément au Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université du Zhejiang. Les rats SD ont été assignés au hasard à des groupes, y compris des microsphères d'hydrogel vierges, en béton vierge et en béton induit, pour évaluer le potentiel ostéogénique dans un défaut crânien lors de l'implantation de microsphères d'hydrogel. Des rats SD ont été anesthésiés avec une injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique à 2 %. Après un rasage et une désinfection complets, une incision longitudinale a été pratiquée au milieu de la zone chirurgicale, puis les tissus mous ont été soigneusement séparés pour exposer le calvarium. Le périoste a été arraché et deux défauts bilatéraux de 5 mm de diamètre ont été créés avec un trépan dentaire. Les microsphères d'hydrogel ont ensuite été implantées dans les défauts. La pénicilline a été injectée une fois par jour après l'opération pendant trois jours.

Après 2 et 4 semaines d'implantation, les rats (n = 5 dans chaque groupe) ont été euthanasiés par suffocation au CO2, et l'échantillon crânien a été récolté et fixé dans du paraformaldéhyde à 4 % (p/v) pour une caractérisation plus poussée. Les structures tridimensionnelles (3D) du tissu osseux régénéré dans la zone du défaut crânien ont été évaluées par micro-CT (SkyScan, SkyScan 1176, Belgique) avec les paramètres de numérisation suivants : une résolution de 18 μm, une tension de 65 kV, un courant de 385 μA et un filtre A1 de 0,5 mm. La reconstruction 3D a été réalisée avec un logiciel système (SkyScan, Belgique). Le rapport du volume osseux au volume tissulaire (BV/TV) a été déterminé quantitativement avec un cylindre ROI de 5 mm de diamètre.

Après 2 et 4 semaines d'implantation, les spécimens récoltés ont été fixés dans du paraformaldéhyde à 4 % (p/v) pendant 48 h et décalcifiés dans une solution d'acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA) à 15 % pendant 2 semaines à température ambiante. La solution EDTA a été renouvelée tous les 3 jours. Les échantillons ont ensuite été déshydratés par une série d'alcools gradués et inclus dans de la paraffine. Des coupes histologiques d'une épaisseur approximative de 5 μm ont été obtenues à partir du centre des échantillons intégrés, suivies d'une coloration à l'hématoxyline et à l'éosine (H&E) ou au trichrome de Masson pour évaluer la formation osseuse. Les images ont été obtenues sous un microscope à fond clair (Olympus, Tokyo, Japon).

Les différentes morphologies de défaut crânien ont été créées avec un trépan dentaire (diamètre 5 mm, hauteur 1,5). Les morphologies des défauts des "patients" I, II et III étaient respectivement de forme rectangulaire, carrée et trapézoïdale, avec 2, 4 et 5 cercles, et l'entraxe était de 1 mm. La morphologie du défaut du "patient" IV était de forme triangulaire avec 3 cercles et l'entraxe était de 4 mm. Les modèles de défauts ont été reconstruits dans Solidworks et tranchés avec le logiciel Repetier pour acquérir les informations de chemin, suivi d'un transfert vers le programme de contrôle correspondant qui utilisait le logiciel de contrôle du système de bras robotique. Le débit de la bioencre a été fixé à 150 μL/min et la vitesse de déplacement de la buse a été fixée à 120 mm/min. La buse en forme de cône 20G a été sélectionnée comme buse d'impression. Le point d'origine X – Y de la buse a été défini en fonction du bord arrière droit du défaut crânien, et le point d'origine Z a été défini en fonction du point le plus élevé du crâne autour du défaut. La pompe d'injection était fixée à l'extrémité du système de bras robotisé. Après l'impression de la bioencre A – C, la bioencre déposée a été réticulée avec une lumière bleue à 405 nm pendant 30 s, et le cuir chevelu a été suturé et stérilisé.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les auteurs déclarent que toutes les données à l'appui des conclusions de cette étude sont disponibles dans le document et ses informations supplémentaires ou auprès des auteurs correspondants sur demande.

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Cette étude a été parrainée par le National Key Research and Development Program of China (2018YFA0703000, YH), la National Natural Science Foundation of China (No. U1909218, YH), le Science Fund for Creative Research Groups of the National Natural Science Foundation of China (No. T2121004, YH).

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Mingjun Xie, Yang Shi.

State Key Laboratory of Fluid Power and Mechatronic Systems, School of Mechanical Engineering, Zhejiang University, 310027, Hangzhou, Chine

Mingjun Xie, Jingbo Zhang, Zichen Chen, Jianzhong Fu et Yong He

Key Laboratory of 3D Printing Process and Equipment of Zhejiang Province, School of Mechanical Engineering, Zhejiang University, 310027, Hangzhou, Chine

Mingjun Xie, Jingbo Zhang, Zichen Chen, Jianzhong Fu et Yong He

Hôpital de stomatologie, École de stomatologie, École de médecine de l'Université du Zhejiang, 310006, Hangzhou, Chine

Yang Shi, Chun Zhang, Mingjie Ge et Zhijian Xie

Centre provincial de recherche clinique du Zhejiang pour les maladies bucco-dentaires, 310006, Hangzhou, Chine

Yang Shi, Chun Zhang, Mingjie Ge et Zhijian Xie

Laboratoire clé de recherche biomédicale orale de la province du Zhejiang, 310006, Hangzhou, Chine

Yang Shi, Chun Zhang, Mingjie Ge et Zhijian Xie

Centre de cancérologie, Université du Zhejiang, 310058, Hangzhou, Zhejiang, Chine

Yong-il

Key Laboratory of Materials Processing and Mold, Université de Zhengzhou, 450002, Zhengzhou, Chine

Yong-il

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MX a effectué toutes les expériences de fabrication et in vitro et a rédigé l'article avec la contribution de tous les auteurs. YS a réalisé les expérimentations animales et la caractérisation. CZ et MG ont aidé à effectuer les expérimentations animales et la caractérisation. JZ a participé à la conception d'un programme de parcours de bioimpression in situ et à l'exploitation d'un bras robotique. JF, ZC et ZX ont contribué à la conception de l'étude. YH a organisé le projet et a donné des suggestions de projet.

Correspondance avec Yong He.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Junji Fukuda et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Xie, M., Shi, Y., Zhang, C. et al. Bioimpression 3D in situ avec bioink bioconcrete. Nat Commun 13, 3597 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-30997-y

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Reçu : 09 novembre 2021

Accepté : 20 mai 2022

Publié: 23 juin 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-30997-y

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Communication Nature (2022)

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