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Oct 20, 2023

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Volume Communication Nature

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 3385 (2022) Citer cet article

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Les grappes extrêmement rares de cellules tumorales circulantes (CTC) sont à la fois de plus en plus appréciées en tant que précurseurs hautement métastatiques et pratiquement inexplorées. Les technologies sont principalement conçues pour détecter des CTC uniques et ne parviennent souvent pas à tenir compte de la fragilité des grappes ou à tirer parti des marqueurs spécifiques aux grappes pour une sensibilité plus élevée. Pendant ce temps, les quelques technologies ciblant les clusters CTC manquent d'évolutivité. Ici, nous introduisons le Cluster-Wells, qui combine la rapidité et la praticité de la filtration membranaire avec le dépistage sensible et déterministe offert par les puces microfluidiques. Les > 100 000 micropuits dans les Cluster-Wells arrêtent physiquement les clusters CTC dans le sang total non traité, isolant doucement pratiquement tous les clusters à un débit > 25 mL/h, et permettent de récupérer les clusters viables de l'appareil. À l'aide de Cluster-Wells, nous avons isolé des grappes de CTC allant de 2 à plus de 100 cellules de patients atteints de cancer de la prostate et de l'ovaire et analysé un sous-ensemble à l'aide du séquençage de l'ARN. L'isolement systématique des grappes de CTC démocratisera la recherche sur leur utilité dans la gestion du cancer.

Les cellules tumorales circulantes uniques (CTC) récoltées dans la circulation sanguine des patients atteints de cancer fournissent des informations précieuses sur le stade de la maladie1, permettent un pronostic et un diagnostic peu invasifs2,3,4, améliorent notre compréhension des métastases au niveau cellulaire5,6 et offrent le potentiel d'améliorer la gestion clinique du cancer7,8. En plus de ces CTC simples, les agrégats de CTC qui restent attachés en circulation ont suscité un grand intérêt scientifique et clinique depuis les années 1950. Bien que ces grappes de CTC, ou microembolies tumorales circulantes, soient extrêmement rares (estimées à seulement 2 à 5 % de tous les CTC), elles sont disproportionnellement efficaces pour semer des métastases. On estime que leur propension métastatique est 100 fois supérieure à celle des CTC simples9,10,11, sur la base de leur taux d'apoptose plus faible et de leurs attributs de survie prolongée réduits9,12. De plus, un sous-ensemble de grappes de CTC dérivées de patients s'est avéré inclure des cellules immunitaires hôtes13,14, soulignant l'utilité de ces précurseurs métastatiques pour faire la lumière sur les interactions tumeur-système immunitaire et leur rôle dans les métastases. Par exemple, il a été démontré que les grappes de CTC portant des neutrophiles avaient un potentiel métastatique accru chez les patientes atteintes d'un cancer du sein avancé14, où les CTC associées aux neutrophiles présentent des niveaux d'expression plus élevés de la protéine marqueur de prolifération (Ki67) et des gènes associés à la progression du cycle cellulaire. Des études cliniques ont soutenu les résultats de ces investigations biologiques, constatant que la présence de grappes de CTC est associée à une survie sans progression et à une survie globale des patients plus courtes15. L'étude accrue des grappes de CTC est donc très prometteuse pour améliorer la compréhension et la gestion des métastases.

À ce jour, l'isolement fiable et efficace des grappes de CTC viables a été limité car la sensibilité et la spécificité des technologies d'isolement de CTC sont principalement calibrées pour la détection de cellule unique16,17,18,19. Les techniques de microfiltration, par exemple, sont largement utilisées comme dosages CTC en raison de leur fonctionnement simple et rapide16,19,20. Cependant, les grappes de CTC sous pression physiologique peuvent se réorganiser en structures en forme de chaîne à fichier unique et traverser des constrictions aussi petites que 5 μm11, ce qui suggère que les agrégats peuvent probablement passer à travers les pores du filtre, étant donné les pressions beaucoup plus élevées utilisées dans la filtration. De plus, des forces de cisaillement plus élevées subies lors de la microfiltration pourraient endommager les grappes de CTC ou les dissocier en cellules uniques21, compromettant ainsi un enrichissement efficace. D'autre part, les systèmes d'enrichissement à base d'anticorps, qui ont longtemps été utilisés pour l'isolement de CTC uniques17,22,23, ne peuvent détecter qu'une sous-population sélectionnée de grappes de CTC au sein de la population hétérogène de CTC en raison de leur dépendance à des antigènes membranaires spécifiques13,24. De plus, le plus petit rapport surface/volume des grappes de CTC a un impact négatif sur l'efficacité de l'immunocapture des technologies à base d'anticorps25, les rendant particulièrement inefficaces pour l'enrichissement des grappes de CTC. Plus prometteuses à cet égard sont les puces microfluidiques récentes ciblant spécifiquement les clusters CTC, qui peuvent atteindre des sensibilités relativement plus élevées. Malheureusement, ils le font soit à des taux de traitement cliniquement irréalisables21,26, soit sous la menace de dommages aux grappes en raison des débits élevés dans les canaux étroits27, une préoccupation particulièrement pertinente pour les grandes grappes, qui seraient parfois composées de dizaines de cellules tumorales28.

Pour répondre à ces limitations pour l'isolement et l'étude des clusters CTC, nous avons développé le Cluster-Wells. Ce dispositif polymère à haute sensibilité et haut débit isole en douceur les grappes de CTC, petites et grandes, à partir d'échantillons de sang total non traités sans qu'il soit nécessaire de cibler des antigènes spécifiques à la tumeur. Au lieu de cela, le Cluster-Wells conserve les clusters CTC dans des micropuits conçus pour reconnaître physiquement les agrégats cellulaires et préserver leur intégrité sous des débits sous-physiologiques. De plus, un accès illimité aux grappes de CTC purifiées dans des micropuits permet une enquête plus approfondie par imagerie et analyses fonctionnelles et moléculaires.

Le Cluster-Wells capture les clusters CTC dans des micropuits conçus pour retenir les agrégats cellulaires tout en étant perméables aux cellules individuelles dans le sang (Fig. 1a). Au fond de chaque puits se trouve un micromesh avec des ouvertures de 15 μm × 15 μm, une taille qui laisse passer les leucocytes, les érythrocytes et les plaquettes sans entrave. Ainsi, le sang total non traité circule facilement à travers le dispositif, mais les grappes de CTC, trop grandes pour être engagées dans une seule ouverture, sont capturées lorsque des cellules individuelles au sein de la grappe se logent dans les ouvertures de maille voisines. Une fois à l'intérieur d'un puits, les grappes de CTC sont contraintes sur le maillage par des parois latérales inclinées, qui limitent la réorientation potentielle sous l'écoulement et protègent les cellules des contraintes transversales dommageables que l'on trouve dans les filtres à membrane traditionnels.

a Illustration schématique du principe de fonctionnement du Cluster-Wells. Alors que les cellules individuelles passent sans entrave, le Cluster-Wells capture les clusters CTC en raison de leur morphologie multicellulaire à partir d'échantillons de sang de patients cancéreux, indépendamment du type de cancer et de leur caractère moléculaire. b Une photo du Cluster-Wells fabriqué sous la forme d'une membrane de 47 mm de diamètre à utiliser dans un porte-filtre commercial. L'image en gros plan (en médaillon) montre des puits individuels conçus pour capturer des grappes de CTC. (Droite) Micrographie électronique à balayage d'un cluster LNCaP enrichi de sang tel que capturé par l'un des puits de l'appareil (voir "Méthodes": préparation et imagerie de l'échantillon SEM). Barre d'échelle, 20 μm. c Illustration schématique du processus de fabrication développé pour mouler le dispositif Cluster-Wells en polymère. Les étapes illustrées sur la figure excluent le processus de fabrication du moule en silicone et la construction d'un moule PDMS réutilisable, que l'on peut trouver dans les figures supplémentaires. 2 et 3. Micrographies électroniques à balayage de la structure PDMS utilisée pour le micromoulage (en bas à droite) et le dispositif fini fabriqué à partir de polymère photodurcissable, MD700 (en bas à gauche). Barres d'échelle, 50 μm.

Les lignes de maillage sont conçues pour être minces (~ 2 μm de large), elles fonctionnent donc comme un coin entre les cellules, forçant les cellules du cluster dans différentes ouvertures et arrêtant le cluster aux jonctions cellule-cellule. Pour se prémunir contre la dissociation des grappes par les lignes de maillage, la vitesse d'écoulement des cellules a été fixée à 65 μm / s (Fig. 1 supplémentaire), environ 10 fois inférieure à la vitesse d'écoulement libre physiologique dans les capillaires humains29. Pour maintenir une manipulation douce des clusters CTC tout en atteignant des taux de débit cliniquement pertinents, nous avons exploité un grand nombre de puits de piégeage de cluster en parallèle. Même au débit spécifié, 120 000 micropuits uniformément répartis sur une membrane de 47 mm de diamètre ont fourni un débit de traitement de 25 mL/h (Fig. 1b).

Nous avons conçu le Cluster-Wells comme un dispositif polymère jetable pour assurer une fabrication rapide et peu coûteuse qui rendrait la technologie accessible dans une variété de milieux de recherche et cliniques. Le procédé de microfabrication combinait des techniques de micro-usinage du silicium30, de lithographie douce31 et de micromoulage32 (voir "Méthodes" : microfabrication du maître-moule en silicium et moulage des Cluster-Wells à partir du maître en silicium). Nous avons d'abord fabriqué un moule négatif en silicium à l'aide d'un processus de microfabrication à 3 masques qui impliquait un dépôt de couche mince avec des étapes de gravure ionique humide et réactive (Fig. 2 supplémentaire). Le moule en silicone a ensuite été transféré dans du polydiméthylsiloxane (PDMS) et répliqué par lithographie douce. Le moule PDMS négatif résultant a été rempli d'un polymère photodurcissable (Fluorolink MD700, Solvay) et réticulé dans le moule pour former le dispositif (Fig. 1c). Le dispositif fabriqué était de 65 μm d'épaisseur et structurellement rigide, permettant une manipulation facile. Ce processus nous permet de transférer la géométrie complexe uniquement réalisable avec le micro-usinage du silicium vers des dispositifs en plastique abordables et jetables.

Pour tester et optimiser le fonctionnement de Cluster-Wells, nous avons traité des échantillons préparés en dopant des grappes artificiellement formées de lignées cellulaires cancéreuses humaines dans des échantillons de sang prélevés sur des donneurs sains selon un protocole approuvé par l'IRB (voir "Méthodes : culture cellulaire et préparation et prélèvement d'échantillons). Dans ces expériences, les grappes de cellules tumorales ont été soit pré- soit post-marquées avec des colorants fluorescents pour une identification positive. Le sang total additionné de grappes a été conduit à travers un Cluster-Wells placé dans un porte-filtre commercial, suivi d'un lavage avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et d'une coloration immunofluorescente des cellules sur le dispositif. Les grappes capturées ont été identifiées dans des micropuits par microscopie à fluorescence (Fig. 2a).

a Images de fluorescence représentatives d'un cluster LNCaP capturé enrichi dans du sang total non traité. Après le lavage et la fixation au PBS, les cellules tumorales isolées ont été colorées avec de la cytokératine (vert) et du DAPI (noyaux, bleu). Barres d'échelle, 20 μm. b Illustration schématique du montage expérimental utilisé pour les études de caractérisation. Les cellules entrant et sortant des versions analytiques du Cluster-Wells ont été suivies visuellement et comptées pour les calculs d'efficacité de capture à l'aide d'une interface microfluidique à 2 canaux (voir "Méthodes": mesure de la sensibilité de l'appareil). c Efficacité de capture des grappes pour les grappes enrichies de LNCaP à différents débits. Les données sont fournies en fonction du nombre de cellules dans les grappes (n = 3 expériences indépendantes). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD. d Taux de capture de grappes à deux cellules pour les grappes de cellules cancéreuses de la prostate (LNCaP), du sein (MDA-MB-231 et MCF-7) et de l'ovaire (HeyA8) au débit de 25 ml/h (n = 3 expériences indépendantes). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD. Étant donné que le Cluster-Wells repose uniquement sur les attributs physiques des clusters, il a capturé efficacement des clusters de différents types de tumeurs, indépendamment de leurs antigènes de surface. e Efficacités de capture de cluster LNCaP à deux, trois et quatre cellules pour les dispositifs avec différentes tailles d'ouverture (n = 3 expériences indépendantes). Les expériences ont été réalisées à un débit de 25 mL/h. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD. f Taux de rétention des globules blancs (WBC) pour les dispositifs avec différentes tailles d'ouverture après traitement d'un tube (10 ml) de sang total non traité (n = 3 expériences indépendantes). Les globules blancs non spécifiquement attachés ont été colorés et comptés. Pour le calcul du taux de rétention, le nombre de globules blancs obtenu a été divisé par le nombre total de globules blancs parcourus par l'appareil, qui a été acquis à partir d'un analyseur de numération globulaire complète (CBC). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Pour déterminer l'efficacité de capture des Cluster-Wells sous différents débits, nous avons imagé et comparé les populations de cluster enrichies entrant et sortant de l'appareil. Nous avons construit une interface microfluidique à 2 canaux pour imager chaque cluster traité au microscope, ce qui nous a permis de suivre simultanément les cellules cancéreuses fluorescentes dans le sang total lors de leur entrée et de leur sortie dans le même champ de vision (Fig. 2b) (voir "Méthodes": mesure de la sensibilité de l'appareil). Pour ces expériences, nous avons coloré les noyaux cellulaires plutôt que les membranes cellulaires ou le cytoplasme pour fournir une meilleure distinction visuelle entre les cellules et faciliter un dénombrement plus précis des cellules au sein des grappes. De plus, la vitesse d'imagerie a été réglée suffisamment élevée pour (1) sécuriser plusieurs (> 4) prises de vue de chaque groupe, garantissant qu'aucun des groupes n'a été manqué et (2) capturer plusieurs conformations différentes dans le champ de vision, augmentant la précision de l'estimation de la taille du groupe. Nous avons validé (voir "Méthodes": mesure de la sensibilité de l'appareil) la configuration de caractérisation optimisée en faisant fonctionner l'interface microfluidique à 2 canaux dans une boucle sans l'appareil attaché pour confirmer qu'il n'y avait pas de perte de cellules dans le système (tableau supplémentaire 1) et également en s'assurant que le nombre de grappes obtenu à l'aide de notre configuration correspondait aux comptages directs des grappes capturées sur l'appareil (Fig. 4 supplémentaire).

À l'aide de Cluster-Wells, nous avons traité des échantillons de sang total additionnés de grappes de cellules cancéreuses humaines de la prostate (LNCaP) à des débits allant de 25 à 750 ml/h (Fig. 2c). À 25 mL/h, l'appareil a isolé presque tous les clusters, ne manquant que ~6,8 % des doublets. À 250 ml/h, un débit qui permet le dépistage d'un tube de sang total en seulement ~ 2 minutes, les cellules traversaient toujours les micropuits à des vitesses d'écoulement physiologiques, et l'appareil a capturé tous les amas de cellules tumorales composés de 6 cellules ou plus, ~ 98,7 % des amas de 5 cellules, ~ 93,8 % des amas de 4 cellules, ~ 89,3 % des amas de 3 cellules et ~ 75,8 % des doublets. Uniquement à des débits> 500 ml / h, les amas de cellules enrichies se dissocient dans l'appareil, comme en témoigne le décalage observé entre les distributions de taille des populations de cellules enrichies et traitées (Fig. 5 supplémentaire).

Pour étudier la sensibilité de l'appareil lors du traitement des grappes de cellules tumorales de différents types de cancer, nous avons également traité des échantillons enrichis de grappes de lignées cellulaires cancéreuses du sein (MDA-MB-231 et MCF-7) et de l'ovaire (HeyA8). Ces cellules tumorales ont des propriétés biochimiques et biophysiques différentes de celles des cellules cancéreuses de la prostate précédemment testées, ainsi que des différences d'affinités de cellule à cellule. Même ainsi, à 25 ml/h, le Cluster-Wells a capturé 90 % ou plus des doublets, le type de cluster le plus évasif, pour toutes les lignées cellulaires tumorales, ce qui confirme l'applicabilité de cette technologie aux cancers de différents tissus (Fig. 2d). Pour mettre en perspective la sensibilité mesurée de l'appareil : le Cluster-Wells capture les doublets avec deux fois la sensibilité rapportée d'un Cluster-Chip21 de taille similaire, un appareil qui s'est déjà avéré plus sensible pour capturer les clusters que les techniques optimisées pour les CTC simples, tout en criblant le sang 10 fois plus rapidement (Fig. 6 supplémentaire). En fait, lorsque les deux plates-formes filtrent les échantillons au même débit (50 ml/h), le Cluster-Wells capture les plus petits clusters avec une efficacité presque d'un ordre de grandeur (~ 9 ×) supérieure sur la base des taux de capture publiés21 du Cluster-Chip. Même lors du dépistage du sang total à un débit de 100 mL/h, le Cluster-Wells est plus sensible que toutes les méthodes d'enrichissement en grappes CTC, ne manquant que ~10,4 % des doublets et ~2,7 % des triplets.

Afin d'optimiser la géométrie de l'appareil pour l'isolation du cluster CTC, nous avons étudié l'effet de la taille d'ouverture du micromesh sur les performances de l'appareil. En plus des Cluster-Wells décrits dans cet article, nous avons conçu une version avec des ouvertures plus petites (13,5 μm) et une autre avec des ouvertures plus grandes (16,5 μm). En testant à nouveau avec du sang total additionné de cellules cancéreuses humaines de la prostate (LNCaP), nous avons constaté que les tailles d'ouverture ajustées présentaient des compromis entre la sensibilité et la spécificité de la capture de grappes. Alors que chaque appareil, testé à 25 mL/h, pouvait capturer tous les clusters plus grands (4+ cellules), un maillage de 16,5 μm a entraîné une diminution d'environ 20 % de l'efficacité de la capture du doublet et une diminution d'environ 2,5 % de la capture des clusters à 3 cellules (Fig. 2e). À l'inverse, la diminution de l'ouverture à 13, 5 μm a augmenté l'efficacité de capture du doublet d'environ 5%, pour un total de capture d'environ 98%. Cependant, l'ouverture de maille plus petite a également diminué la spécificité, permettant une contamination leucocytaire supérieure d'environ 60% en moyenne (Fig. 2f). Cependant, étant donné que la plupart des leucocytes ne sont pas piégés mécaniquement mais adhèrent plutôt à des surfaces de manière non spécifique à des emplacements aléatoires, l'augmentation des ouvertures de maille offrait des gains de spécificité décroissants : des ouvertures de maille plus grandes (16,5 μm) réduisaient la contamination des leucocytes de seulement ~ 20 %. En pesant à la fois les données de pureté et d'efficacité de capture recueillies, nous avons identifié l'ouverture de maille de 15 μm comme le choix de conception optimal, qui a donné une contamination moyenne d'environ 28,8 globules blancs (WBC)/mm2 (<0,06 %) avec ~331 plaquettes/mm2 (<0,025 %) à partir du traitement d'un échantillon de sang total non manipulé de 10 mL dans nos tests.

Étant donné que la libération de clusters CTC viables est cruciale pour les essais moléculaires et fonctionnels en aval, nous avons construit le Cluster-Wells à partir d'un polymère à faible énergie de surface à base de fluor (Fluorolink MD700, Solvay) pour améliorer la récupération des clusters en minimisant l'adhérence cellulaire non spécifique, un inconvénient documenté des dispositifs basés sur PDMS21. Pour évaluer les performances de libération de Cluster-Wells, nous avons tenté de récupérer des amas de cellules tumorales viables capturés sur l'appareil (Fig. 3a). Après avoir traité des échantillons de sang total additionnés de grappes de LNCaP à 25 ml/h, nous avons lavé les Cluster-Wells avec du PBS et libéré les grappes dans des boîtes de Pétri à différentes vitesses de flux inverse. En utilisant la microscopie à fluorescence pour identifier à la fois les grappes libérées avec succès dans la boîte de Pétri collectrice et celles qui sont restées sur l'appareil sous chaque vitesse testée, nous avons calculé l'efficacité de la libération des grappes pour déterminer la vitesse de flux inverse optimale. L'efficacité de libération a augmenté avec des vitesses d'écoulement inverse plus élevées, ce qui a déplacé davantage de grappes non spécifiquement adhérées à l'appareil. Nous avons conclu que sous un débit inverse moyen de ~ 6, 5 mm / s dans les micropuits (100 × la vitesse du flux de capture) pendant ~ 10 secondes, presque tous (~ 96%) des grappes pouvaient être récupérées avec succès (Fig. 3b). De plus, nous avons confirmé que l'intégrité des grappes libérées était préservée en comparant directement la taille des populations de grappes capturées et relâchées (Fig. 7 supplémentaire).

a Représentation du processus de libération. Les grappes de LNCaP ont été ajoutées au sang total et traitées à l'aide de Cluster-Wells. Après le lavage au PBS, les grappes capturées ont été libérées dans une boîte de Pétri par l'application d'un flux inverse. b Efficacité de libération de l'appareil à différentes vitesses relatives d'écoulement inverse. Après la libération, la boîte de Pétri et l'appareil ont été imagés à l'aide d'un microscope à fluorescence, et les cellules ont été comptées manuellement pour le calcul de l'efficacité de la libération (n = 3 expériences indépendantes). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD. c Pourcentage de viabilité du contrôle et des grappes libérées dans une boîte de Pétri à une vitesse d'écoulement inverse de 6,5 mm/s (n = 3 expériences indépendantes). Le test de viabilité bicolore a été réalisé sur les cellules témoins et libérées à l'intérieur des boîtes de Pétri (voir "Méthodes" : mesure de la viabilité cellulaire), qui ont ensuite été scannées au microscope à fluorescence. Le nombre de cellules viables et mortes a été compté pour calculer le pourcentage de cellules viables. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD. d Une photo du Cluster-Wells et du capillaire d'un micromanipulateur à l'intérieur d'un micropuits individuel. Contrairement aux dispositifs microfluidiques, les micropuits individuels sont facilement accessibles à l'aide d'un micromanipulateur. e Images au microscope à fluorescence des Cluster-Wells après avoir été retirés du porte-filtre. En raison de la tension superficielle, la solution de colorant fluorescent précédemment introduite reste à l'intérieur des puits et le contenu des micropuits individuels peut être récupéré à l'aide d'un micromanipulateur. Lorsqu'ils sont laissés sans surveillance, les micropuits sèchent en ~ 10 min. Barres d'échelle, 50 μm. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

L'efficacité de récupération mesurée du Cluster-Wells est supérieure au taux de récupération de cluster précédemment rapporté de Cluster-Chip21 basé sur PDMS. Imitant les conditions de test rapportées pour le Cluster-Chip dans nos expériences, nous avons utilisé le Cluster-Wells pour traiter des échantillons de sang enrichis avec des clusters MDA-MB-231 et avons tenté de libérer les agrégats capturés. En utilisant la même vitesse d'écoulement inverse (6, 5 mm / s) et la même durée précédemment appliquées avec le Cluster-Chip, nous avons pu récupérer des clusters de Cluster-Wells avec> 2 × (87% vs 37%) l'efficacité du Cluster-Chip (Fig. 8 supplémentaire). Même par rapport à l'efficacité de libération rapportée d'un Cluster-Chip opéré à 4 ° C pour réduire l'adhésion cellulaire non spécifique à la puce microfluidique, le Cluster-Wells a démontré une plus grande efficacité (récupération de 87% pour le Cluster Wells contre 80% pour le Cluster-Chip).

Ensuite, à l'aide d'un test de cellules vivantes/mortes, nous avons étudié la viabilité des cellules tumorales capturées puis libérées des Cluster-Wells (voir "Méthodes": mesure de la viabilité cellulaire) (Fig. 9 supplémentaire). Pour ces mesures, les grappes de LNCaP capturées à partir d'échantillons de sang dopés par les Cluster-Wells ont été libérées sous flux inverse à 6,5 mm/s. La viabilité moyenne des grappes libérées (~ 95, 8%) s'est avérée similaire à celle de la population témoin (~ 96, 3%), démontrant que ni le dispositif ni le protocole de libération n'ont produit d'effet important sur la viabilité cellulaire (Fig. 3c).

Pour évaluer si nous pouvions tirer parti de la disposition exposée des Cluster-Wells pour récupérer des cellules, nous avons également étudié si des clusters viables pouvaient être capturés directement à partir de micropuits à l'aide d'un micromanipulateur (Fig. 3d). Tout d'abord, nous avons testé si les grappes capturées pouvaient être conservées en toute sécurité dans les micropuits pendant que l'appareil était configuré pour la micromanipulation. En comparant le nombre de grappes imagées sur l'appareil exposé avec le nombre de grappes enrichies, nous avons constaté que la majorité (~ 95,8 %) des grappes étaient conservées sur l'appareil exposé. Nous avons ensuite effectué un test séparé pour déterminer si l'appareil avec ses micropuits poreux sécherait prématurément une fois sorti du porte-filtre et exposé, ce qui interdirait la collecte de grappes viables. Nous avons rempli le Cluster-Wells avec une solution de colorant fluorescent et avons constaté que l'hydrophobicité de l'appareil combinée à la tension superficielle empêchait le liquide de fuir à travers le micromesh par gravité (Fig. 3e). De plus, au fur et à mesure que le liquide s'évaporait sur la surface du dispositif exposé, les micropuits étaient les derniers à sécher, offrant un isolement naturel entre les puits afin que leur contenu puisse être collecté sans diaphonie (Fig. 3e).

Pour évaluer l'application clinique potentielle du dispositif, nous avons appliqué la technologie Cluster-Wells pour isoler des grappes de CTC à partir d'échantillons de sang de patients atteints de cancer de l'ovaire et de la prostate. Les échantillons de sang, dont le volume varie de 2,8 à 24 ml, ont été prélevés sur des patients consentants conformément aux protocoles approuvés par l'IRB à l'Université Emory et aux hôpitaux Northside et traités à Georgia Tech dans les 4 h suivant le prélèvement (voir "Méthodes : prélèvement et traitement des échantillons). Après la fixation des cellules isolées avec du paraformaldéhyde (PFA) à 4 %, les échantillons ont été immunocolorés avec des marqueurs de leucocytes et contre des marqueurs de cancer établis pour la maladie spécifique ; une coloration nucléaire (4,6-diamidino-2-phénylindole) a également été appliquée pour identifier positivement les clusters CTC des patients (voir "Méthodes": coloration par immunofluorescence des clusters CTC). Les grappes immunocolorées ont ensuite été imagées et analysées en balayant les Cluster-Wells sous un microscope à fluorescence. La spécificité du test a également été validée pour les deux types de cancer en traitant 10 ml d'échantillons de sang de donneurs sains (n ​​= 3 chacun), qui ont tous été confirmés comme étant absents des grappes de CTC.

Nous avons détecté des grappes de CTC dans les échantillons de sang de patients atteints de cancer de l'ovaire (Fig. 4a) et de la prostate (Fig. 4b). Le nombre de cellules dans ces grappes variait de 2 à plus de 150 cellules, ces dernières étant trouvées dans un échantillon d'une patiente atteinte d'un cancer de l'ovaire (Fig. 4a, iii). En plus de soulever des questions sur la circulation physiologique des clusters CTC, la taille étonnamment grande du cluster CTC isolé du cancer de l'ovaire indique un inconvénient potentiel des puces microfluidiques, même si elles sont conçues avec les clusters CTC à l'esprit : un cluster CTC de cette taille aurait probablement obstrué des canaux microfluidiques étroits ou se serait divisé en plus petits morceaux s'il était forcé. Certains des clusters de CTC isolés contenaient également des leucocytes dans les échantillons de cancer de l'ovaire et de la prostate (Fig. 4a, ii et b, iii), une observation cohérente avec les rapports précédents sur les clusters de CTC du cancer du sein14. Pour confirmer la cohésion physique entre les cellules de ces grappes de CTC associées aux leucocytes, ces grappes ont été délibérément expulsées des micropuits, puis recapturées.

a Images au microscope à fluorescence des grappes de CTC isolées de patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire. Les cellules capturées ont été colorées avec de la cytokératine, de la vimentine (vert), du CD45 (rouge) et du DAPI (noyaux, bleu). Barres d'échelle, 20 μm. b Images des grappes de CTC isolées de patients atteints d'un cancer de la prostate métastatique. Les cellules capturées ont été colorées avec de la cytokératine, de la vimentine, du PSA/KLK3, de l'EpCAM (vert), du CD45 (rouge) et du DAPI (noyaux, bleu). Barres d'échelle, 20 μm. c Grappes isolées de l'échantillon de sang périphérique et d'ascite prélevé dans la cavité péritonéale d'une patiente atteinte d'un cancer de l'ovaire au même moment. Le cluster CTC isolé était morphologiquement différent par rapport aux sphéroïdes tumoraux isolés à partir d'un échantillon d'ascite du même patient. Les sphéroïdes de l'échantillon d'ascite ont été fixés et colorés avec la cytokératine, l'EpCAM (rouge), le CD45 (vert) et le DAPI (noyaux, bleu), et les grappes de CTC isolées de l'échantillon de sang ont été fixées et colorées avec la cytokératine, la vimentine (vert), CD45 (rouge) et DAPI (noyaux, bleu). Barres d'échelle, 20 μm. d Pourcentage de patients atteints d'un cancer de la prostate (n = 8) et de l'ovaire (n = 9) dont on observe qu'ils présentent des grappes de CTC dans leurs échantillons de sang. e Nombre de grappes de CTC observées par millilitre d'échantillons de sang provenant de patients atteints d'un cancer de la prostate et de l'ovaire. f Distribution du nombre de cellules observées dans les clusters CTC de la prostate et des ovaires. Les diagrammes en boîte montrent les 25e et 75e centiles, la ligne montre la médiane et les moustaches montrent les points maxima et minima. g Pourcentage de grappes de CTC associées à des globules blancs et purs pour chaque type de maladie. h Images des grappes de CTC isolées d'une patiente atteinte d'un cancer de l'ovaire et soumises à un test de viabilité basé sur la fluorescence. Les images montrent des grappes de CTC composées (i) de cellules vivantes et mortes (jaunes) et (ii) de cellules vivantes uniquement. Barres d'échelle, 20 μm. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Pour tester l'applicabilité des Cluster-Wells dans l'isolement des agrégats cellulaires à partir de fluides corporels autres que le sang total, nous avons tenté d'isoler des sphéroïdes tumoraux à partir d'un échantillon d'ascite prélevé sur une patiente atteinte d'un cancer de l'ovaire (voir "Méthodes": traitement des échantillons). La concentration de sphéroïdes de cellules tumorales observée dans l'échantillon d'ascite était significativement plus élevée que celle des grappes de CTC observées dans un échantillon de sang périphérique prélevé sur le même patient au même moment (~ 1500 sphéroïdes/mL contre 0,167 grappes de CTC/mL). De plus, il a été observé que les cellules tumorales des sphéroïdes isolés étaient morphologiquement plus grandes que celles des grappes de CTC que nous avons isolées de l'échantillon de sang (Fig. 4c et Fig. 10 supplémentaire).

Parmi la cohorte de patients que nous avons étudiée (tableaux supplémentaires 2 et 3), des grappes de CTC ont été détectées chez 6/8 patients atteints d'un cancer de la prostate et chez 8/9 patients atteints d'un cancer de l'ovaire (Fig. 4d). Le nombre de grappes de CTC détectées variait considérablement d'un patient à l'autre, avec des concentrations allant de 0,063 à 0,867 grappes/mL chez les patientes atteintes d'un cancer de la prostate et de 0,167 à 59,2 grappes/mL chez les patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire (Fig. 4e). En moyenne, les clusters CTC du cancer de l'ovaire étaient composés de plus de cellules tumorales que les clusters CTC du cancer de la prostate avec une médiane de 6 cellules contre 3 cellules dans le cancer de la prostate (Fig. 4f). De plus, 26,4% des grappes de CTC de cancer de l'ovaire isolées contenaient des globules blancs, tandis que 16,4% des grappes de CTC de cancer de la prostate contenaient des globules blancs (Fig. 4g). Dans l'ensemble, l'hétérogénéité phénotypique observée dans les grappes de CTC isolées par les Cluster-Wells atteste de la plage dynamique élevée et des conditions de traitement douces offertes par la technique. De plus, une concentration plus élevée (0,43/mL contre 0,28/mL21) de grappes de cancer de la prostate détectées par les Cluster-Wells par rapport à la Cluster-Chip, bien que dans des cohortes différentes, pourrait potentiellement être due à l'efficacité d'isolement supérieure des Cluster-Wells, compte tenu de la petite taille des grappes CTC du cancer de la prostate.

Il est important de noter que les grappes de CTC étaient nettement plus répandues dans la cohorte de patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire, avec une concentration moyenne de 10,32 grappes/mL. La fréquence élevée de grappes de CTC chez les patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire, en particulier à la lumière des études antérieures sur les CTC uniques dans le cancer de l'ovaire33, suggère des capacités d'intravasation très efficaces des cellules cancéreuses de l'ovaire. De plus, en étudiant la viabilité des grappes de CTC de l'une des patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire (voir "Méthodes : évaluation de la viabilité des grappes de CTC isolées à partir d'échantillons de patientes), nous avons constaté que les grappes de CTC isolées par Cluster-Wells contenaient des cellules tumorales viables (Fig. 4h), ce qui a encore souligné les avantages de l'enrichissement rapide mais doux fourni par la technologie. Dans l'ensemble, l'isolement de grappes de CTC viables pourrait donc être particulièrement utile pour le diagnostic et la surveillance du cancer de l'ovaire34.

Pour démontrer la faisabilité d'utiliser Cluster-Wells pour isoler des clusters CTC viables pour des essais moléculaires en aval, nous avons effectué le séquençage de l'ARN sur des clusters CTC individuels de deux patients atteints de cancer de la prostate (voir "Méthodes": préparation et séquençage de la bibliothèque d'ARN et analyse des données de séquençage de l'ARN). Les cellules non fixées sur le Cluster-Wells ont d'abord été immunocolorées contre des antigènes membranaires spécifiques à la tumeur et des marqueurs de leucocytes, et des grappes de CTC fluorescentes ont été prélevées directement à partir des micropuits pour le séquençage à l'aide d'un micromanipulateur (Fig. 5a) (voir "Méthodes": micromanipulation de grappes de CTC à partir d'échantillons de patients). Comme les échantillons pour les études moléculaires ont été soumis à un protocole de coloration différent ciblant exclusivement les marqueurs de surface (Fig. 5b), ils n'ont pas été inclus dans le dénombrement des grappes de CTC chez les patients atteints d'un cancer de la prostate.

a Micromanipulation d'un cluster CTC isolé à partir de l'échantillon de sang d'un patient atteint d'un cancer de la prostate métastatique (Patient-1). Après la filtration du sang et le lavage au PBS, des grappes de CTC viables isolées ont été colorées sur l'appareil à l'aide d'anticorps conjugués au FITC contre l'EpCAM et l'antigène membranaire spécifique de la prostate (PSMA), scannés à l'aide d'un microscope à fluorescence et micromanipulés directement à partir de l'appareil. Barres d'échelle, 50 μm. b Images représentatives au microscope à fluorescence des grappes de CTC de la prostate soumises à l'ARN-Seq. Les images ont été prises avant d'être extraites de l'appareil pour l'analyse moléculaire. Barres d'échelle, 20 μm. c Parcelle d'intégration stochastique voisine distribuée en t (t-SNE) des groupes de patients séquencés, des lignées cellulaires du cancer de la prostate et des globules blancs. d Graphique de carte thermique illustrant les niveaux d'expression de gènes sélectionnés dans des grappes de CTC isolées de deux patients atteints d'un cancer de la prostate métastatique, des lignées cellulaires du cancer de la prostate et des globules blancs. Lectures RPM par million.

Un total de 6 grappes de CTC ont été séquencées à partir de deux patients atteints d'un cancer de la prostate, ainsi que deux ensembles de WBC et deux grappes de lignées cellulaires de cancer de la prostate LNCaP et PC-3 chacune. À partir des groupes de patients, nous avons obtenu une médiane de 83,15 millions de lectures par échantillon, avec une médiane de 74 millions de lectures cartographiées de manière unique (~ 88,8 %) et un score Phred moyen de 36 pour la qualité moyenne de la séquence. Nous avons détecté un total de 16 412 transcrits uniques et utilisé l'ensemble des transcrits détectés pour effectuer une analyse t-SNE afin de comparer les groupes de patients aux globules blancs témoins et aux lignées cellulaires du cancer de la prostate (Fig. 5c) et avons observé que différents groupes du même patient ou de la même lignée cellulaire avaient tendance à se regrouper.

Tout d'abord, nous avons effectué une analyse DESeq2 comparant les groupes de patients aux globules blancs pour identifier les transcrits exprimés de manière différentielle et avons identifié un total de 3718 transcrits (p-adj < 0,01). L'ensemble de la liste classée des transcriptions détectées a été utilisée pour l'analyse de l'enrichissement de l'ensemble de gènes36 à l'aide de WebGestalt37, et nous avons observé de nombreux ensembles de gènes hautement significatifs enrichis dans les groupes de patients, notamment les gènes cibles MYC, les gènes de point de contrôle G2M, la cible E2F et les gènes de réponse aux œstrogènes (Figs supplémentaires. 12 et 13) à partir des ensembles de gènes Hallmark 50 et des collections d'ensembles de gènes de la voie KEGG. Ces ensembles de gènes sont cohérents avec les cellules prolifératives induites par les hormones telles que les cellules tumorales malignes38,39,40. De plus, les groupes de patients ont été enrichis négativement pour les ensembles de gènes liés aux cellules immunitaires tels que les gènes de cytotoxicité des cellules tueuses naturelles, les gènes de la maladie du greffon contre l'hôte, les gènes de réponse gamma à l'interféron et les gènes de différenciation Th1/Th2, entre autres, ce qui suggère que le transcriptome de ces groupes différait des cellules immunitaires saines de l'hôte (Fig. 14 supplémentaire).

L'analyse des transcriptions correspondant à un ensemble sélectionné de gènes pour le cancer de la prostate a montré que tous les groupes de CTC exprimaient des niveaux élevés de marqueurs épithéliaux (Fig. 5d). Parmi les marqueurs épithéliaux, la molécule d'adhérence des cellules épithéliales (EpCAM), la E-cadhérine (CDH1) et la cytokératine (KRT) 8, 18 et 19 étaient fortement exprimées dans tous les clusters CTC, tandis que les clusters CTC du patient-2 exprimaient également KRT5. Parmi les marqueurs mésenchymateux, la vimentine (VIM), une indication de l'induction de la transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT)41, a été exprimée par la plupart des clusters CTC à des niveaux relativement inférieurs mais détectables. En plus des marqueurs tumoraux établis, des groupes de patients ont également été criblés pour les cellules souches et les marqueurs associés à la prolifération. Parmi les marqueurs de cellules souches, CD24 étaient exprimés dans tous les clusters CTC à des niveaux variables, tandis que 5/6 clusters exprimaient des niveaux élevés (> 50 tr/min) de CD44. Il a été rapporté précédemment que les interactions homophiles CD44 et les interactions CD44-PAK2 ultérieures médient l'agrégation des cellules tumorales42 et améliorent la souche, la survie et la progression métastatique43,44. De même, tous les clusters CTC ont exprimé des niveaux élevés de TIMP1, JUN et FOS, qui sont connus pour stimuler la prolifération cellulaire, inhiber l'apoptose et réguler l'angiogenèse45,46. De plus, nous avons effectué une analyse d'enrichissement de surreprésentation pour l'ensemble de gènes "TOMLINS_PROSTATE_CANCER_UP" de la base de données MSigDB du Broad Institute, qui répertorie les gènes régulés positivement dans le cancer de la prostate par rapport aux tissus bénins47. Comme observé à partir du tracé de la carte thermique, tous les clusters CTC ainsi que les lignées cellulaires du cancer de la prostate exprimaient des niveaux élevés de ces gènes compatibles avec leur origine tumorale de la prostate. Nous avons également effectué une analyse similaire pour l'ensemble de gènes "CHANDRAN_METASTASIS_TOP50_UP" de la base de données MSigDB, qui comprend les gènes régulés positivement dans les tumeurs métastatiques du cancer de la prostate par rapport au tissu primaire48. La régulation à la hausse des gènes associés aux métastases dans tous les clusters est en accord avec le potentiel métastatique accru des clusters CTC9,10. Parmi l'ensemble, nous avons observé les niveaux d'expression les plus élevés dans les gènes HSPD1 et HSP90AA1 qui sont membres des protéines de choc thermique (HSP), jouant un rôle important dans le développement et l'invasion du cancer, la progression, les métastases et la résistance aux médicaments dans divers types de cancer. En outre, tous les clusters CTC ont exprimé des niveaux élevés de G3BP1 qui ont été corrélés avec le degré malin de la tumeur51 et observés comme étant les plus abondants dans le cancer de la prostate résistant à la castration (CRPC)52, ce qui concorde avec le diagnostic clinique du patient-1 et du patient-2 (tableau supplémentaire 2).

Dans cette étude, nous introduisons une technologie d'isolement cellulaire qui détecte sélectivement les grappes de CTC dans des échantillons de sang non traités de patients atteints de cancer. En capturant les grappes de CTC directement dans des micropuits d'ingénierie gravés sur une membrane polymère, le Cluster-Wells offre des avantages par rapport aux autres méthodes de recherche de ces précurseurs métastatiques dans des échantillons de sang. Premièrement, le nombre massif de micropuits criblant en parallèle les constituants sanguins permet d'analyser des échantillons cliniques en quelques minutes, tout en garantissant l'intégrité des clusters CTC en les soumettant exclusivement à des vitesses d'écoulement inférieures à celles de la circulation physiologique. Deuxièmement, le format de dispositif planaire permet la mise en forme de pièges à micropuits directement dans le plan de contact avec les clusters CTC, ce qui élimine le caractère aléatoire de l'interaction cluster-trap et permet même de capturer des doublets avec une sensibilité élevée. Troisièmement, l'isolement des grappes de CTC dans des micropuits au lieu d'un filtre à membrane traditionnel les protège des contraintes externes pendant ou après le traitement, les laissant accessibles pour les analyses en aval et éliminant le besoin d'étaler les cellules sur un plat. Enfin, le test de cluster CTC développé ne nécessite qu'un porte-filtre commercial et aucun matériel spécialisé supplémentaire autre qu'une pompe, ce qui le rend facilement intégrable dans la recherche fondamentale ou les flux de travail cliniques.

En utilisant le Cluster-Wells sur des échantillons de sang cliniques, nous avons trouvé des grappes de CTC chez des patientes atteintes d'un cancer de la prostate et de l'ovaire. Notamment, des grappes de CTC ont été trouvées dans le sang périphérique de la plupart des patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire à des concentrations relativement élevées. Cette découverte est importante car on pense que la propagation du cancer de l'ovaire aux organes environnants dans la cavité péritonéale est principalement médiée par des agrégats cellulaires dans l'ascite, dont la présence est associée à une maladie récurrente chimio-résistante et à un mauvais pronostic53,54. Alors que les grappes de CTC se sont avérées composées de cellules plus petites que les sphéroïdes tumoraux dans l'ascite, elles étaient aussi grandes que> 150 cellules dans les échantillons testés, deux observations apparemment en contradiction l'une avec l'autre et qui ont des implications potentielles pour la circulation des grappes de CTC dans le corps. La fréquence des grappes de CTC dans le sang périphérique des patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire peut présenter des opportunités précieuses pour une étude plus approfondie afin de mieux comprendre la dissémination hématogène du cancer de l'ovaire55 ainsi que des opportunités de détection précoce de l'apparition de la maladie et de la récurrence de la tumeur - deux problèmes majeurs pour le cancer de l'ovaire, puisque la maladie est asymptomatique au début de sa progression/récurrence56.

Le séquençage de l'ARN de clusters CTC individuels collectés à partir de micropuits a permis d'étudier non seulement l'hétérogénéité tumorale inter-patients, mais également l'hétérogénéité intra-patient des clusters CTC et a révélé des caractéristiques normalement cachées dans l'analyse au niveau des tissus. Tous les clusters isolés de cancer de la prostate se sont avérés exprimer fortement des marqueurs épithéliaux à des niveaux variables, tout en ayant une faible expression de marqueurs mésenchymateux. Chaque groupe de patients s'est avéré exprimer de manière cohérente la plupart des gènes signalés comme étant régulés positivement dans le cancer de la prostate, conformément à leur identité en tant qu'origine de la tumeur de la prostate. En outre, la régulation à la hausse des marqueurs associés aux cellules souches et les niveaux d'expression élevés des gènes associés au caractère invasif des cellules tumorales de la prostate dans tous les groupes de CTC isolés étaient en accord avec les rapports précédents sur le succès métastatique considérablement amélioré de ces agrégats cellulaires. Outre ces traits communs, l'analyse comparative des transcriptomes de groupes de CTC individuels a également révélé des profils distincts spécifiques aux patients. Les grappes isolées du premier patient exprimaient AR, KLK3 (PSA) ou FOLH1 (PSMA), affichant un profil similaire aux cellules LNCaP sensibles aux androgènes séquencées comme l'un des témoins positifs pour les cellules cancéreuses de la prostate. En revanche, dans tous les groupes isolés du deuxième patient, ces gènes spécifiques de la prostate se sont avérés être régulés à la baisse, tout comme dans les cellules PC-3 indépendantes des androgènes, qui ont été incluses comme l'autre type de cellule cancéreuse de la prostate témoin positif dans notre étude.

Le Cluster-Wells permet un dépistage rapide et un isolement à haute sensibilité des grappes de CTC intactes à partir d'échantillons de sang total non traités sans dépendre d'étiquettes spécifiques à la tumeur, maximisant ainsi l'isolement efficace des cellules cancéreuses hétérogènes. En utilisant des lots de pièges à grappes conçus avec précision et établis sur un filtre à membrane polymère, le Cluster-Wells capture et préserve même les grappes de CTC les plus fragiles pour une enquête plus approfondie. Parce que le Cluster-Wells peut facilement être intégré aux flux de travail cliniques ou de recherche sans préparation d'échantillon, formation technique compliquée ou instrumentation spécialisée autre qu'une pompe, c'est un outil qui peut aider à démocratiser les enquêtes sur le rôle des clusters CTC dans les métastases cancéreuses et également établir leur utilité clinique en tant que marqueurs pronostiques pour la gestion de la maladie.

Des échantillons de sang de donneurs sains consentants ont été prélevés au Georgia Institute of Technology. L'étude a inclus 7 participants en bonne santé (5 hommes, 2 femmes, âgés de 24 à 37 ans). Les échantillons de sang de patients atteints de cancer de la prostate ont été prélevés à l'hôpital universitaire Emory et au Grady Memorial Hospital, et les échantillons de sang et d'ascite de patients atteints de cancer de l'ovaire ont été prélevés à l'hôpital Northside. L'étude a inclus 10 patients atteints d'un cancer de la prostate (hommes, âgés de 59 à 71 ans) et 10 patients atteints d'un cancer de l'ovaire (femmes, âgés de 27 à 78 ans). Toutes les collectes ont été effectuées selon des protocoles approuvés par les comités d'examen institutionnels de l'hôpital Northside, de l'Université Emory et du Georgia Institute of Technology. Les participants n'ont pas été indemnisés pour leur inscription.

Le moule principal, c'est-à-dire le motif négatif du Cluster-Wells, a été fabriqué à partir d'une plaquette de silicium de 500 μm d'épaisseur et de 4 pouces de diamètre (100) en utilisant un processus à trois masques (Fig. 2 supplémentaire). Le photorésist SC1813 (Shipley, Marlborough, MA) a été utilisé comme premier masque. Après le filage et la structuration de la résine photosensible, la tranche de Si a été gravée à une profondeur de 8 μm à l'aide d'une gravure ionique réactive profonde (DRIE) pour former les piliers carrés. Ensuite, une fine couche (300 nm) de nitrure à faible contrainte a été déposée dans un four LPCVD. Pour modeler le nitrure déposé, la plaquette a été recouverte d'un photorésist positif SPR 220-7.0 (Shipley, Marlborough, MA) et exposée par un aligneur sans masque (Heidelberg MLA150). La couche de nitrure sous la région exposée a été gravée en utilisant une gravure ionique réactive pour former un masque dur pour le processus de gravure humide. Le silicium a été gravé de manière anisotrope dans une solution de KOH à 45 % à 80 °C pendant 15 min pour former les parois inclinées. Enfin, afin de former le motif négatif des micropuits, un photorésist SPR 220-7.0 a été utilisé comme masque pour graver des tranchées carrées de 50 μm de profondeur dans la plaquette à l'aide de DRIE. Après le nettoyage du piranha (mélange 3: 1 d'acide sulfurique concentré (H2SO4) avec du peroxyde d'hydrogène (H2O2)) à 120 ° C pendant 10 min, la plaquette de silicium micro-usinée a été recouverte de trichloro (octyl) silane sous vide pendant 8 h avant coulée PDMS.

Après le micro-usinage d'un maître-moule en silicium (voir Méthodes : moulage des puits de cluster à partir du maître en silicium, Fig. 2 supplémentaire), la préparation du moule en polydiméthylsiloxane (PDMS) et la structuration du dispositif en polymère ont été réalisées dans un environnement de laboratoire. Tout d'abord, le prépolymère PDMS et son agent de réticulation (Sylgard 184, Dow Corning, Auburn, MI) ont été mélangés à un rapport de 10: 1 et versés sur le maître-moule en silicium. Après dégazage dans un dessiccateur pendant une heure, le PDMS a été durci dans un four à 65 ° C pendant 4 h, puis coupé et décollé du maître-moule en silicium (Fig. 3a, i supplémentaires). La surface de la couche de PDMS a été activée à l'aide d'un plasma d'oxygène et recouverte de trichloro(octyl)silane pendant 8 h. Une couche de PDMS précédemment fabriquée et revêtue de silane a été utilisée comme moule pour la fabrication du moule PDMS secondaire, ayant le motif négatif du dispositif (Fig. 3a, ii supplémentaires). Après le décollement (Fig. 3a, iii supplémentaires), un moule PDMS secondaire a été utilisé pour modeler le polymère à base de perfluoropolyéther (PFPE) photodurcissable (Fluorolink MD700, Solvay), qui est utilisé comme matériau du dispositif. Après le processus de moulage PDMS à PDMS, le moule PDMS secondaire (Fig. 3b, i supplémentaire) a été placé sur une feuille de polyéthylène téréphtalate (PET) et rempli de Fluorolink MD700 mélangé avec 4 % en poids de 2-hydroxy-2-méthylpropiophénone (Darocur 1173) sous un vide de 50 mbar. Une fois le moule rempli, le polymère est durci à la lumière UV (Fig. 3a, iv), le moule PDMS secondaire a été décollé de la pile de feuilles/dispositifs en PET (Fig. 3a, v supplémentaire) et le dispositif (Fig. 3b supplémentaire, ii-iv) a été libéré de la feuille de PET sous-jacente sur un refroidisseur thermoélectrique à 4 ° C, ce qui facilite la libération du dispositif polymère sans aucun dommage (Fig. 3a, vi supplémentaire).

Pour la caractérisation des Cluster-Wells, nous avons utilisé des versions analytiques des appareils ayant une surface de filtration efficace plus petite. Lors de l'utilisation d'une gamme de débits de 1 à 1,5 mL/h en raison de la limitation de la fréquence d'images d'enregistrement de la caméra, les vitesses d'écoulement aux micromailles ont été arrangées en faisant varier la taille des appareils, où la diminution de la taille correspondait à l'augmentation du débit. Dans ces études de caractérisation, le volume d'échantillon de sang a également été ajusté, dans des limites pratiques, pour s'assurer que le nombre de cellules sanguines traitées par chaque micropuits était similaire à celui du dispositif réel (avec un diamètre de 47 mm) lors du traitement de 10 ml de sang total pour chaque condition testée. Par conséquent, nous avons utilisé ~750, ~375 et ~200 μL de sang total pour tester les performances de l'appareil pour des débits de 25, 100 et >250 mL/h, respectivement. Des dispositifs de plus petit diamètre ont été montés sur un porte-filtre de 13 mm de diamètre disponible dans le commerce (GE Healthcare Life Sciences) avec des couches creuses de PDMS correspondant à la taille, qui limitent l'écoulement du fluide vers la région d'intérêt avec un certain diamètre et empêchent la formation de région d'écoulement stagnante à l'intérieur du porte-filtre. Avant d'introduire l'échantillon, la configuration expérimentale (Fig. 2b) a été amorcée avec de l'éthanol pur, suivi d'un lavage au PBS. Ensuite, la configuration a été incubée avec 3% d'albumine de sérum bovin (BSA) pendant 1 h pour minimiser l'adhésion cellulaire non spécifique. Les cellules colorées au colorant Hoechst (voir la section séparée sur la culture et la préparation des cellules) ont été enrichies dans du sang total et parcourues dans la configuration expérimentale à l'aide d'une pompe à seringue (Harvard Apparatus Infuse/Withdraw PHD Ultra) en mode de retrait. Le sang avec des grappes de cellules dopées traversé par le canal d'entrée (50 μm de hauteur, 500 μm de largeur) de l'interface microfluidique à 2 canaux, l'ensemble de support de dispositif/filtre et enfin, le canal de sortie (50 μm de hauteur, 500 μm de largeur) de l'interface microfluidique. Les canaux microfluidiques d'entrée et de sortie ont été simultanément enregistrés en vidéo à 50 images par seconde dans un canal fluorescent (DAPI) à l'aide d'un microscope à fluorescence inversé (Eclipse Ti, Nikon, Melville, NY) pour suivre les cellules entrant et sortant de la version analytique du Cluster-Wells, respectivement. Ensuite, la vidéo enregistrée a été traitée par un logiciel personnalisé (Visual Studio, 2017), et le nombre de grappes entrant et sortant de l'appareil a été obtenu par rapport au nombre de cellules dans chaque grappe, qui est utilisé pour le calcul de l'efficacité de capture.

Pour tester la fiabilité du système d'imagerie, nous avons fait fonctionner l'interface microfluidique à 2 canaux dans une boucle sans l'appareil attaché, où la sortie du canal d'entrée était connectée à l'entrée du canal de sortie à l'aide d'un tube ID de 8 cm de long de 0,02". ic canaux Après avoir analysé les trames, nous avons observé qu'il n'y avait pratiquement aucune perte dans le système lorsque la distribution de taille des clusters passant par les canaux d'entrée et de sortie ont été comparés (tableau supplémentaire 1). Pour évaluer la validité des données obtenues à l'aide de la configuration microfluidique, nous avons effectué des expériences d'efficacité de capture à 25 mL/h en comptant directement les clusters isolés sur l'appareil. Dans ces expériences, la population enrichie a été imagée à l'aide d'un canal microfluidique comme décrit précédemment pour avoir un nombre exact de clusters enrichis. Les grappes ont été injectées dans un tube EDTA contenant 10 ml de sang total et l'échantillon de sang dopé a ensuite été traité à 25 ml/h à l'aide de Cluster-Wells. L'appareil a été imagé à l'aide d'un microscope à fluorescence et le nombre de grappes capturées a été comparé à la population enrichie pour mesurer l'efficacité de capture (Fig. 4 supplémentaire), qui correspondait aux données d'efficacité de capture obtenues à l'aide de l'interface microfluidique.

Comme échantillons biologiques modèles, nous avons utilisé les lignées cellulaires HeyA8 (obtenues auprès du Dr John F. McDonald, Georgia Institute of Technology), LNCaP (ATCC-CRL-1740 ; Manassas, VA), MDA-MB-231 (ATCC-HTB-26 ; Manassas, VA) et MCF-7 (ATCC-HTB-22 ; Manassas, VA). Les lignées cellulaires ont été cultivées dans un milieu RPMI-1640 (LNCaP et HeyA8) ou DMEM (MDA-MB-231 et MCF-7) contenant 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) (Seradigm, Radnor, PA) dans une atmosphère à 5 % de CO2 à 37 °C. Une fois qu'elles ont atteint 80% de confluence, les cellules ont été détachées du flacon de culture en utilisant 0,25% de trypsine (Gibco) pendant 2 min. Ensuite, les cellules ont été culottées, le surnageant a été retiré et les cellules ont été remises en suspension dans une solution de PBS 1X par pipetage doux. Pour toutes les lignées cellulaires utilisées dans cette étude, les cellules granulées se sont d'abord avérées adhérer les unes aux autres en groupes de centaines à des milliers de cellules et ont ensuite été dissociées en grappes plus petites dans la plage de taille d'intérêt pour notre étude mécaniquement par pipetage.

Pour les expériences d'efficacité de capture, une coloration nucléaire a été réalisée pour le suivi visuel des grappes. Avant de détacher les cellules de la surface du flacon, les noyaux des cellules ont été marqués en incubant les cellules dans une solution de colorant Hoechst 33342 (Thermo Fisher - Cat No: H3570) de 4 ml (1: 1000) pendant 20 min dans une atmosphère à 5% de CO2 à 37 ° C. Après lavage de la solution de coloration, les cellules ont été détachées et remises en suspension dans une solution de PBS 1X. De petites aliquotes (<10 μL) de la suspension ont été utilisées pour préparer les échantillons de test contenant quelques centaines (184 à 552 grappes) de grappes de cellules par expérience. Le nombre de grappes enrichies dans nos expériences a été défini pour garantir (1) que la population de grappes enrichies était suffisamment grande pour contenir des grappes de différentes tailles pour un test complet et (2) que le nombre de grappes ne saturait pas l'appareil avec la majorité des puits restant vides.

Pour déterminer la viabilité des cellules, un test vivant/mort (ab115347, Abcam, Cambridge, MA) a été effectué conformément aux instructions du fabricant. Le test a été mélangé à une concentration 5x (1:200) avec la solution PBS 1x contenant les cellules témoins et libérées. Après l'incubation dans un environnement sombre pendant 15 min, les échantillons ont été imagés avec un microscope à fluorescence inversé (Eclipse Ti, Nikon, Melville, NY), où les cellules vivantes et mortes ont été observées dans les canaux vert (FITC) et rouge (TexasRed), respectivement (Fig. 9 supplémentaire).

Les amas capturés ont d'abord été fixés dans du glutaraldéhyde à 2,5 % puis dans du tétroxyde d'osmium à 1 %, tous deux dilués dans du cacodylate de sodium 0,1 M. Après fixation, les cellules ont été déshydratées dans des solutions d'éthanol à 50 %, 70 %, 80 et 95 % dans de l'eau et de l'éthanol à 100 % successivement pendant 15 minutes chacune. L'échantillon a été lavé avec de l'hexaméthyldisilazane (HMDS) (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) et séché à température ambiante pendant une nuit. Le dispositif et les amas capturés ont été recouverts de Pt/Pd à l'aide d'un système de pulvérisation et imagés à l'aide d'un microscope électronique à balayage Hitachi SU8230.

Des échantillons de sang de donneurs sains consentants ont été prélevés au Georgia Institute of Technology selon un protocole approuvé par l'IRB. Les échantillons de sang de patients atteints de cancer de la prostate ont été prélevés à l'hôpital universitaire Emory et au Grady Memorial Hospital, et les échantillons de sang et d'ascite de patients atteints de cancer de l'ovaire ont été prélevés à l'hôpital Northside selon des protocoles approuvés par l'IRB. Les échantillons de sang ont été prélevés dans des tubes EDTA (BD Vacutainer) et traités dans les 4 heures suivant le prélèvement sanguin. Pour éviter la sédimentation, les tubes ont été placés sur une bascule jusqu'à leur utilisation. Des échantillons d'ascite provenant de patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire ont été transférés au Georgia Institute of Technology dans des récipients en verre sous vide et traités dans les 4 h suivant le retrait.

Les dispositifs ont été placés à l'intérieur des porte-filtres et humidifiés avec de l'éthanol pur. Après le mouillage, l'éthanol a été lavé avec du PBS 1X. Avant utilisation, l'ensemble dispositif/porte-filtre a été incubé avec 3 % de BSA pendant 1 h pour minimiser l'adhésion cellulaire non spécifique sur les surfaces. Ensuite, la BSA a été lavée avec du PBS 1 × avant l'introduction d'échantillons de sang ou d'ascite. Des échantillons d'ascite et de sang total non traité ont été passés dans les dispositifs à l'aide d'une pompe à seringue (Harvard Apparatus Infuse/Withdraw PHD Ultra) en mode prélèvement à un débit de 25 ml/h. Ensuite, les dispositifs ont été lavés à l'aide d'une solution de PBS 1 × pendant 1 h avant la coloration par immunofluorescence (voir la section séparée sur la coloration par immunofluorescence des grappes de CTC).

Après traitement des échantillons, les cellules capturées ont été fixées avec du paraformaldéhyde à 4 % (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) pendant 10 min, puis perméabilisées avec du Triton-X à 1 % (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) dans du PBS pendant 10 min. Avant la coloration par immunofluorescence, l'ensemble dispositif/porte-filtre a été incubé avec un tampon de blocage contenant 2 % de sérum de chèvre et 3 % de BSA pendant 30 min. Pour les échantillons de prostate, Cytokeratin 8/18 (Invitrogen - Cat No: MA5-32118, Clone: ​​SU0338, (1:400)), Vimentin (Invitrogen - Cat No: MA5-14564, Clone: ​​SP20, (1:1000)), PSA/KLK3 (Cell Signaling Technology - Cat No: 5365S, Clone: ​​D6B1, (1:750)), Ep CAM (Invitrogen - Cat No : MA5-29246, Clone : 28, (1:400)) et Anti-CD45 (BD Biosciences - Cat No : 555480, Clone : HI30, (1:500)), et pour les échantillons ovariens, Cytokeratin 7 (Invitrogen - Cat No : MA5-32173, Clone : ST50-05, (1:400)), Cytoker atin 8/18 (Invitrogen - Cat No: MA5-32118, Clone: ​​SU0338, (1:400)), Vimentin (Invitrogen - Cat No: MA5-14564, Clone: ​​SP20, (1:1000)) et Anti-CD45 (BD Biosciences - Cat No: 555480, Clone: ​​HI30, (1:500)) un cocktail d'anticorps primaires a été introduit et incubé mangé du jour au lendemain. Les anticorps en excès ont été lavés avec du PBS 1X. Ensuite, les anticorps secondaires correspondants Alexa Fluor 488 (Invitrogen - Cat No : A-11008, (1:500)) et Alexa Fluor 594 (Invitrogen - Cat No : A21125, (1:500)) ont été passés à travers l'appareil, incubés pendant 1 h et lavés avec 1 × PBS. Les noyaux des cellules ont été colorés avec du 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (Invitrogen - Cat No: D1306, (1: 1000)) pendant 10 min et les dispositifs ont été lavés avec du PBS 1 ×. Enfin, les dispositifs ont été retirés des porte-filtres et montés entre deux lames de verre pour l'imagerie.

Les grappes de CTC vivantes capturées ont été colorées avec des anticorps conjugués à Alexa 488 contre EpCAM (Cell Signaling Technology - Cat No: 5198S, (1: 400)), l'antigène membranaire spécifique de la prostate (PSMA) (Biolegend - Cat No: 342506, Clone: ​​LNI-17, (1: 80)), et les globules blancs contaminants ont été colorés avec du PE-CD45 (TRITC) (BioLegend – Cat n° : 368510, Clone : 2D1, (1:40)). Le dispositif avec les grappes capturées a été monté dans une boîte de Pétri, puis imagé à l'aide d'un microscope à fluorescence inversé (Eclipse Ti, Nikon, Melville, NY). Les grappes identifiées ont été directement micromanipulées à partir du dispositif et transférées dans les tubes PCR contenant le tampon RLT (Qiagen) + BME (Sigma-Aldrich) à l'aide du micromanipulateur Eppendorf TransferMan 4r. Au cours de la micromanipulation, la boîte a été complétée avec du PBS 1 × pour empêcher les micropuits de sécher, ce qui a pris environ 10 min à température ambiante. Les tubes ont été vortexés pendant 1 min et transférés dans un congélateur à -80 ° C. On a observé que la plupart des globules blancs contaminants restaient collés au dispositif pendant la récupération des grappes. Néanmoins, les grappes de CTC micromanipulées à partir de Cluster-Wells ont été déchargées dans une boîte de Pétri vide et ont ensuite été repiquées pour s'assurer contre les artefacts potentiels de la contamination WBC dans le séquençage de l'ARN.

L'échantillon de sang a été traité avec le Cluster-Wells à un débit de 25 mL/h. Les noyaux des cellules capturées ont été colorés avec le colorant Hoechst (Thermo Fisher - Cat No: H3570, (1: 1000)), et les membranes des globules blancs contaminants ont été colorées avec PE-CD45 (TRITC) (BioLegend - Cat No: 368510, (1: 40)) pour l'identification négative des clusters CTC potentiels sur l'appareil. Les grappes de CTC enrichies ont d'abord été imagées sur l'appareil en tant que ligne de base (Fig. 11, i supplémentaire) et les grappes de CTC sur l'appareil ont ensuite été soumises à un test de viabilité basé sur l'intégrité de la membrane, NucRed Dead 647 Ready Probes (Thermo Fisher - Cat No: R37113), selon le protocole fourni par le fabricant. Des images de fluorescence des grappes de CTC testées ont été prises pour enregistrer la fluorescence du colorant rapporteur de viabilité (Cy-5) (Fig. 11, ii supplémentaire). Pour prouver leur origine tumorale, les cellules ont ensuite été fixées avec 4% de PFA, le dispositif a été placé à l'intérieur d'un porte-filtre et un protocole de coloration fixe a été appliqué à l'aide d'anticorps contre la cytokératine 7, 8/18, la vimentine (FITC) et le CD45 (Texas Red) et les grappes ont été imagées avec un microscope à fluorescence (Fig. 11, iii supplémentaire). Le test de viabilité a ensuite été validé en analysant les grappes de CTC fixes en tant que contrôle négatif et les grappes de CTC ont été imagées une fois de plus avec un microscope à fluorescence pour confirmer un résultat de viabilité négatif en raison d'une membrane compromise des cellules fixées (Fig. 11 supplémentaire, iv).

L'ARN a été extrait des échantillons lysés à l'aide du kit Macherey-Nagel Nucleospin RNA XS. L'ADNc double brin a été généré à l'aide du kit d'ARN à entrée ultra faible Takara Bio SMART-Seq v4 pour le séquençage. Des bibliothèques de séquençage compatibles avec Barcode Illumina ont ensuite été générées à l'aide du kit de préparation de bibliothèques d'ADN Illumina Nextera XT avec un temps de tagmentation réduit de 3 min et les échantillons ont été nettoyés à l'aide d'un rapport de perles de 1: 1 pour éliminer la présence de dimères d'amorces. Les qualités des bibliothèques ont été déterminées sur le bioanalyseur Agilent à l'aide d'une puce à ADN haute sensibilité et les concentrations ont été déterminées à l'aide du fluoromètre Invitrogen Qubit. Les échantillons à code-barres ont ensuite été regroupés et séquencés sur Illumina NextSeq 500 et NovaSeq 6000.

Les fichiers fastq bruts ont été analysés pour la qualité à l'aide de FASTQC et coupés à l'aide de TrimGalore (réf : https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore) pour supprimer les séquences d'adaptateur et les lectures de mauvaise qualité (score Phred minimum> 24). Les lectures coupées ont été cartographiées sur la version hg38 du génome humain à l'aide du mappeur STAR (PMID : 23104886) et les transcrits ont été quantifiés en les cartographiant sur la version d'annotation GenCODE.v24 du transcriptome humain. Pour ces grappes de CTC de la prostate, une médiane de 83,15 M de lectures ont été entrées dans le mappeur STAR (plage de 53,7 à 129,79 M), et une médiane de 88,8 % de lectures cartographiées uniquement sur le transcriptome humain (plage de 80,57 à 91,59 %). Un total de 16 412 transcriptions ont été détectées avec au moins 10 lectures cartographiées dans un échantillon et utilisées pour l'analyse DESeq2 dans R (PMID : 25516281). Un total de 12 149 gènes Ensembl cartographiés classés par DESeq2 log2foldchange ont été utilisés comme données d'entrée pour l'analyse GSEA (PMID : 17644558), à l'aide de l'outil WebGestalt (PMID : 28472511). Les ensembles de gènes enrichis ont été analysés à l'aide des ensembles de gènes Cancer Hallmark 50 et des ensembles de gènes KEGG Pathway. L'analyse t-SNE a été effectuée dans R à l'aide du package M3C avec graine = 123 et perplexité = 1. Le nombre total de lectures a été normalisé aux valeurs FPKM à l'aide de Cufflinks (PMID : 22383036). Un total de 26 391 transcrits avaient un FPKM> 1 dans au moins un échantillon, et 10 885 transcrits avaient un FPKM médian> 1. Pour être utilisé dans le tracé de la carte thermique, le nombre de lectures par million (RPM) pour les gènes a été généré. Enfin, le tracé de la carte thermique a été généré à l'aide de l'outil en ligne ClustVis.

Les expériences de caractérisation ont été réalisées en trois expériences indépendantes. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD, sauf indication contraire. Aucune méthode statistique n'a été utilisée pour prédéterminer la taille de l'échantillon. Les expériences n'étaient pas randomisées. Les dispositifs fabriqués ont été choisis au hasard pour les expériences de caractérisation et le traitement des échantillons de patients. Les échantillons de patients ont été répartis en différents groupes en fonction de leur origine tumorale (prostate vs ovaire). La mise en aveugle a été utilisée pour le traitement des échantillons de sang des patients, où toutes les informations sur les patients autres que le type de cancer ont été retenues jusqu'à la fin de l'étude. Les données de séquençage de l'ARN ont été traitées par des pipelines bioinformatiques impartiaux avant l'évaluation par les auteurs. Les expériences représentatives montrées dans les Fig. 1b, 2a, 3e et Figs supplémentaires. 3b, 9, 10 ont été réalisées une fois à des fins d'illustration. De même, les Fig. 4a–c, 5a, b et Figs supplémentaires. 10, 11a, b correspondent à des échantillons de patients spécifiques et les expériences ont été réalisées une fois au moment du traitement de ces échantillons.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les auteurs déclarent que les données à l'appui des conclusions de cette étude sont disponibles dans l'article et son fichier d'informations supplémentaires. Les données de séquençage brutes et traitées générées dans cette étude ont été déposées dans la base de données Gene Expression Omnibus (GEO) du NCBI sous le code d'accession GSE202650. Les ensembles de données accessibles au public utilisés dans cette étude sont les ensembles de gènes Hallmark50 [https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/genesets.jsp?collection=H], la version hg38 du génome humain [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000001405.40], la base de données des voies KEGG [https://www.genome.jp/kegg/ path.html], ensemble de gènes "CHANDRAN_METASTASIS_TOP50_UP" [https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/cards/CHANDRAN_METASTASIS_TOP50_UP], ensemble de gènes "TOMLINS_PROSTATE_CANCER_UP" [https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/cards/TOMLINS_PROSTATE_CAN CER_UP]. Les données sources sont fournies avec ce document.

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Les auteurs tiennent à remercier tous les patients et donneurs de sang sains qui ont participé à cette étude. Les auteurs remercient également le Dr Anton V. Bryksin et Naima Djeddar de Georgia Tech Molecular Evolution Core, Sakeenah Hicks, le Dr Christopher Scharer et le Dr Lyra M. Griffiths d'Emory Integrated Genomics Core (EIGC), et le Dr Henry R. Johnston et le Dr Robert A. Arthur d'Emory Integrated Computational Core (EICC) pour leurs contributions au séquençage de l'ARN et à l'analyse des données ; et le personnel du Georgia Tech Stamps Health Center pour leur aide dans le prélèvement de sang de donneurs sains. Ce travail a été soutenu par les fonds de démarrage fournis à l'AFS par le Georgia Institute of Technology. La recherche a également été soutenue en partie par le Bureau du secrétaire adjoint à la Défense pour les affaires de santé par le biais du programme de recherche sur le cancer de la prostate sous le numéro de prix W81XWH-20-1-0649 (AFS), Georgia Tech Petit Institute Seed Grant (AFS et JFM), le Dunwoody Golf Club Prostate Cancer Research Award et Winship Invest $ Pilot Grant du Winship Cancer Institute de l'Université Emory (AFS et MAB).

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Xérès Tobia

Parker H. Petit Institute for Bioengineering and Bioscience, Georgia Institute of Technology, Atlanta, GA, États-Unis

Shweta Biliya, L. DeEtte McDonald, John F. McDonald et A. Fatih Sarioglu

École des sciences biologiques, Georgia Institute of Technology, Atlanta, Géorgie, États-Unis

L. DeEtte McDonald et John F. McDonald

Winship Cancer Institute, Université Emory, Atlanta, Géorgie, États-Unis

Bassel Nazha, Omer Kucuk, Carlos S. Moreno, Mehmet A. Bilen & A. Fatih Sarioglu

Département d'hématologie et d'oncologie médicale, École de médecine de l'Université Emory, Atlanta, GA, États-Unis

Bassel Nazha, Omer Kucuk & Mehmet A. Bilen

Département d'urologie, École de médecine de l'Université Emory, Atlanta, GA, États-Unis

Martin G. Sanda

Centre intégré de recherche sur le cancer, Georgia Institute of Technology, Atlanta, Géorgie, États-Unis

Benedict B. Benigno, John F. McDonald & A. Fatih Sarioglu

Ovarian Cancer Institute, Atlanta, Géorgie, États-Unis

Benoît B. Benigno et John F. McDonald

Département de pathologie et de médecine de laboratoire, Emory University School of Medicine, Atlanta, GA, États-Unis

Carlos Moreno

Institut d'électronique et de nanotechnologie, Georgia Institute of Technology, Atlanta, Géorgie, États-Unis

A. Fatih Sarioglu

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MB et AFS ont conçu la recherche et rédigé le manuscrit. MB et RL ont fabriqué les appareils. MB a mené les expériences. MB et NA ont développé le logiciel d'analyse. MB et AFS ont analysé les données. ST, LDM, BN, OK, MGS, BBB, MAB et JFM ont aidé à l'acquisition d'échantillons de patients. MB, TOA, BES et CHC ont traité et analysé les échantillons de patients. SB a aidé à la préparation de la bibliothèque et au séquençage de l'ARN. CSM a traité et analysé les données de séquençage. TOA, NA, OC et DL ont contribué à la préparation du manuscrit. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

Correspondance à A. Fatih Sarioglu.

MB et AFS sont les inventeurs d'un brevet déposé au Georgia Institute of Technology (numéro de demande de brevet américain 17/619 276). La demande de brevet couvre la technologie d'isolation de cluster CTC développée. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Sunitha Nagrath et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International License, qui permet l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur n'importe quel support ou format, tant que vous donnez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournissez un lien vers la licence Creative Commons et indiquez si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Réimpressions et autorisations

Boya, M., Ozkaya-Ahmadov, T., Swain, BE et al. Isolement à haut débit et sans étiquette des amas de cellules tumorales circulantes dans des micropuits maillés. Nat Commun 13, 3385 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-31009-9

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Reçu : 23 novembre 2020

Accepté : 26 mai 2022

Publié: 13 juin 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-31009-9

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