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May 12, 2023

Extrait de propolis égyptienne pour la fonctionnalisation de l'hydrogel poreux de nanofibres de cellulose/poly(alcool vinylique) ainsi que la caractérisation et les applications biologiques

Rapports scientifiques volume 13,

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 7739 (2023) Citer cet article

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La propolis d'abeille est l'un des extraits naturels les plus courants et a suscité un intérêt considérable en biomédecine en raison de sa teneur élevée en acides phénoliques et en flavonoïdes, qui sont responsables de l'activité antioxydante des produits naturels. La présente étude rapporte que l'extrait de propolis (PE) a été produit par l'éthanol dans le milieu environnant. Le PE obtenu a été ajouté à différentes concentrations à des nanofibres de cellulose (CNF)/poly(alcool vinylique) (PVA) et soumis à des méthodes de congélation, de décongélation et de lyophilisation pour développer des matrices bioactives poreuses. Les observations au microscope électronique à balayage (SEM) ont montré que les échantillons préparés avaient une structure poreuse interconnectée avec des tailles de pores comprises entre 10 et 100 μm. Les résultats de la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) du PE ont montré environ 18 composés polyphénoliques, avec les quantités les plus élevées d'hespérétine (183,7 µg/mL), d'acide chlorogénique (96,9 µg/mL) et d'acide caféique (90,2 µg/mL). Les résultats de l'activité antibactérienne ont indiqué que les hydrogels PE et PE fonctionnalisés présentaient des effets antimicrobiens potentiels contre Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Streptococcus mutans et Candida albicans. Les expériences de culture de cellules de test in vitro ont indiqué que les cellules sur les hydrogels fonctionnalisés par PE avaient la plus grande viabilité, adhérence et propagation des cellules. Dans l'ensemble, ces données mettent en évidence l'effet intéressant de la bio-fonctionnalisation de la propolis pour améliorer les caractéristiques biologiques de l'hydrogel CNF/PVA en tant que matrice fonctionnelle pour les applications biomédicales.

L'application la plus prononcée des matériaux biocompatibles de type tissu tridimensionnel (3D) consiste à diriger la régénération ou la guérison des tissus après une lésion. Cela repose sur la capacité de ces matériaux à optimiser le microenvironnement physiologique en utilisant des signaux biochimiques, biophysiques et parfois une stimulation mécanique pour améliorer la fonction cellulaire1,2. En effet, les matériaux bioactifs jouent de multiples rôles importants dans le déclenchement de la prolifération et de la différenciation cellulaire, ainsi que dans la minimisation de la réponse inflammatoire qui peut retarder le processus de guérison3,4. Les hydrogels sont des biomatériaux intelligents qui peuvent être appliqués pour la cicatrisation de divers tissus, tels que la peau, le cartilage, les os et les vaisseaux sanguins5. Ils peuvent fournir une structure optimale (3D) similaire à la matrice extracellulaire native (ECM) et permettre la diffusion des gaz, des nutriments et des déchets à travers les réseaux réticulés élastiques6. Au cours des dernières décennies, une variété de matériaux polymères d'origine naturelle ou synthétique ont été utilisés pour développer des hydrogels fonctionnels. Les hydrogels renforcés de fibres sont une classe d'hydrogels composites dans lesquels les réseaux de gel sont généralement renforcés par des structures de fibres pour améliorer les performances mécaniques et également limiter le comportement de gonflement7,8,9.

La cellulose est le polymère d'origine naturelle le plus abondant sur terre, c'est le composant principal des parois cellulaires végétales et de quelques cellules animales10. C'est un homopolysaccharide linéaire constitué d'unités β-d-anhydroglucopyranose, liées par des liaisons β (1→4) éther (liaisons glycosidiques). Les chaînes de cellulose formées sont liées par des liaisons hydrogène pour former des fibrilles constituées de régions amorphes et cristallines. CNF désigne une classe spécifique de nanocelluloses composées de domaines amorphes et hautement ordonnés alternativement associés et généralement obtenus par désintégration mécanique de fibrilles de cellulose11,12. En conséquence, CNF a fait émerger des biomatériaux de taille nanométrique qui affichent une résistance élevée, une surface et une chimie de surface accordable, permettant des interactions contrôlées avec des polymères, des nanoparticules, de petites molécules et des matériaux biologiques. Par exemple, le CNF a été incorporé dans une solution d'alginate et d'alcool polyvinylique pour former un hydrogel stable qui favorise la minéralisation in situ des phosphates de calcium13. En outre, le 2,2,6,6-tétraméthylpipéridine-1-oxyl (TEMPO)-CNF oxydé, qui a des groupes carboxyle, a été greffé par un hydrolysat de protéines de soja via l'amidation des groupes carboxyliques. Le CNF greffé a aidé la minéralisation de l'hydroxyapatite à partir d'un fluide corporel simulé deux fois pour former un nouveau matériau bioactif14.

L'un des polymères hydrophiles utilisés pour produire des hydrogels synthétiques biocompatibles est le PVA, un polymère semi-cristallin. L'hydrogel de PVA peut être physiquement réticulé pour produire des matériaux biocompatibles poreux avec des propriétés de microstructure et de déformation comparables aux membranes biologiques, ce qui les rend idéaux pour les applications biomédicales15,16. La réticulation physique du PVA peut être réalisée par des cycles répétés de congélation et de décongélation. Dans cette méthode, la solution de PVA préparée est congelée, ce qui permet aux cristaux de glace de se former en repoussant les chaînes de PVA et en les emballant dans des espaces confinés. La cristallisation du polymère se produit dans ces régions. Ensuite, à travers le processus de décongélation, les cristaux de glace fondent, formant des cryogels poreux avec des cristaux fonctionnant comme des jonctions de réticulation17. Bien que les hydrogels traditionnels possèdent d'excellentes propriétés telles que la sécurité, la biocompatibilité et une hydrophilie plus élevée, ils ont des performances biologiques limitées. Aujourd'hui, la combinaison d'hydrogel avec des agents thérapeutiques (c'est-à-dire des médicaments, des extraits naturels, des protéines fonctionnelles ou des gènes) représente une méthode efficace pour offrir des environnements plus favorables au processus de régénération tissulaire et pour éviter le métabolisme rapide des agents thérapeutiques18.

La propolis est un sous-produit naturel de l'apiculture utilisé pour la cicatrisation des plaies depuis l'Antiquité. Plus de 300 composés sont présents dans la propolis, et la couleur varie selon la végétation des régions et la source végétale. Selon la végétation régionale, il peut être vert jaunâtre ou brun foncé19. En plus de sécuriser les fissures dans les ruches, la propolis renforce les cellules en nid d'abeille et protège les ruches des invasions microbiennes20. Les principaux composants polyphénoliques de la propolis sont les flavonoïdes et les esters d'acide phénolique, suivis des acides aromatiques, des lignanes et des terpénoïdes21. Habituellement, la cire d'abeille constitue 30 % du mélange, le pollen 5 % et les résines et baumes végétaux 50 %21. En plus des substances balsamiques, résineuses et gommeuses, la propolis contient également du pollen, de la salive et de la cire, et est dérivée des exsudats et des pousses de plantes par les abeilles mellifères22.

Les propriétés antimicrobiennes de la propolis sont attribuées aux flavonoïdes, qui sont efficaces contre les bactéries Gram-positives et Gram-négatives23. De nombreuses propriétés biologiques sont associées à la propolis, notamment des propriétés antibactériennes, antifongiques, antivirales, anti-inflammatoires, anticancéreuses et antitumorales24,25. Des matériaux à base de propolis ont été appliqués comme matériaux de cicatrisation. Par exemple, la propolis sous forme de crème est utilisée pour améliorer la cicatrisation des tissus dermiques et réduire l'inflammation de la plaie mieux que la sulfadiazine d'argent26. Il favorise la prolifération, l'activation et la capacité de croissance des cellules de la peau, sans toxicité ni réactions allergiques.

Récemment, les hydrogels fonctionnels ont attiré une grande attention pour les applications d'ingénierie tissulaire et de régénération en raison de leur hydrophilie, de leur flexibilité et de leur potentiel adhésif inhérent aux tissus biologiques. Ces caractéristiques distinctives jouent un rôle critique dans l'augmentation du temps de séjour d'un ingrédient thérapeutique donné en contact direct avec sa cible biologique. Par conséquent, la présente étude vise à préparer un hydrogel 3D à partir de PVA et de CNF en utilisant les cycles répétés de congélation et de décongélation, en tant qu'hydrogel physiquement réticulé sûr pour une combinaison efficace de PE sans interactions secondaires indésirables avec les agents de réticulation impliqués dans les hydrogels chimiquement réticulés. Les caractéristiques de la microstructure des hydrogels chargés de PE ont été analysées par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FT-IR), SEM et diffraction des rayons X (XRD). En outre, la viabilité des cellules de test in vitro et la fixation aux cellules fibroblastes humaines normales (HFB4) ont été déterminées. Enfin, les potentiels antibactériens et anti-inflammatoires ont également été étudiés, comme résumé dans la Fig. 1.

Représentation schématique des cinq étapes principales des travaux en cours : (A) extrait de propolis ; (B) Préparation de CNF à base de bagasse blanchie ; (C) CNF/PVA chargé de PE ; (D) caractérisation de la microstructure des échantillons obtenus ; et (D) applications biologiques.

La composition chimique du PE peut varier en fonction de la source de nourriture de l'abeille. Par conséquent, il est important d'illustrer la composition chimique du PE pour souligner la présence ou l'absence de certains composés. Comme le montrent le tableau 1 et la figure 2, la méthode de détection HPLC a pu identifier 18 composés polyphénoliques dans le PE, qui jouent un rôle extrêmement important dans son activité biologique. Les composés polyphénols les plus riches en PE étaient l'hespérétine (183,73 µg/mL), l'acide chlorogénique (96,92 µg/mL), l'acide caféique (90,28 µg/mL), la daidzéine (67,89 µg/mL) et l'apigénine (66,59 µg/mL). Alors que la rutine et la vanilline avaient de faibles concentrations de 0,8 et 0,7 µg/mL, respectivement. D'autre part, la seule catéchine non observée dans le PE par rapport au standard. L'origine géographique et le solvant d'extraction de la propolis sont les principaux facteurs qui influent sur la disponibilité et les concentrations des composés polyphénoliques, comme illustré dans le tableau 2.

Empreinte HPLC de PE.

Pour l'oxydation sélective des groupes hydroxyle primaires dans la cellulose (Fig. 3A), l'oxydation médiée par TEMPO est une méthode appropriée pour l'oxydation en C-6 afin de générer des groupes carboxyliques réactifs. La figure 3B montre le spectre FT-IR du CNF, qui présente les pics caractéristiques des chaînes de cellulose35. Une nouvelle bande, cependant, a été observée à 1739 cm-1 qui a été attribuée à l'étirement des groupes carbonyle (C = O), du processus d'oxydation TEMPO. Le CNF préparé a été confirmé par le schéma XRD rapporté sur la figure 3C. Elle montre deux pics principaux de diffraction à 16,4° (110) et 23,1° (200) qui sont caractéristiques de la cellulose native. Aussi, le pourcentage de cristallinité a été estimé selon la méthode Segal et enregistré ∼ 73%36. La structure interne du CNF a également été examinée à l'aide d'une analyse au microscope électronique à transmission (TEM). La figure 3D a montré CNF avec une longueur micrométrique et un diamètre variant de 4 à 20 nm, calculé par analyse d'image. De plus, les nanofibres présentaient une structure uniforme due à la formation homogène de groupes carboxylate à la surface des fibres.

Analyse chimique des matériaux cellulosiques (A) FT-IR de cellulose, (B) FT-IR de CNF, (C) XRD de CNF et (D) image TEM de CNF.

En effet, les hydrogels polymères sont fabriqués par réticulation physique ou chimique, voire les deux. Les hydrogels physiquement réticulés sont obtenus par des interactions faibles, tandis qu'une liaison covalente chimique se forme lorsque les hydrogels sont réticulés chimiquement. Parmi eux, les hydrogels PVA peuvent être simplement formés par la technique de congélation-décongélation. Dans cette étude, des hydrogels chargés de PE à base de CNF et de PVA ont été préparés par simple réticulation physique après des cycles successifs de congélation et de décongélation suivis d'une lyophilisation pour produire des structures 3D poreuses. La figure 4A–C illustre les images SEM des surfaces des hydrogels renforcés de fibres CNF/PVA, CNF/PVA/PE1 et CNF/PVA/PE2, ainsi que les images en coupe transversale pour le même échantillon d'hydrogel. La figure 4D montre les images en coupe pour les mêmes hydrogels. Les images de coupe transversale et de surface confirment la formation de structures poreuses interconnectées rugueuses 3D avec des pores irréguliers dont la taille varie de 10 : 100 µm. Cette structure microporeuse est très importante pour le recrutement cellulaire car elle facilite le transport de l'oxygène et des nutriments. L'introduction de PE dans l'hydrogel entraîne une diminution de la taille des pores et de la rugosité de surface. Cette diminution de la taille des pores suggère la présence de PE à la surface de l'hydrogel qui favorise sa libération rapide lorsqu'il est implanté in vivo. Cette libération rapide d'agents antibactériens tels que le PE est importante pour arrêter l'invasion bactérienne.

Images SEM d'hydrogels renforcés de fibres à différents grossissements (×200, à ×500 et ×1000) et images en coupe associées du même échantillon (×200). (A) CNF/PVA, (B) CNF/PVA/PE1 et (C) CNF/PVA/PE2.

La figure 5 illustre les spectres FT-IR d'échantillons d'hydrogel PVA/CNF chargés de PE et de PE. Le spectre IR de l'échantillon de PE, Fig. 5A, montre une large bande centrée à 3410 cm-1, qui est généralement attribuée à la vibration d'étirement O – H des composés phénoliques37. Les deux bandes à 2920 et 2840 cm−1 sont liées à l'étirement C–H asymétrique et symétrique des composés hydrocarbonés, respectivement38. Tandis que les bandes à 1720 et 1460 cm-1 sont attribuées à la vibration d'étirement du carbonyle C=O de la teneur en flavonoïdes et en lipides. De plus, les bandes à 1370 et 1271 cm−1 sont dues aux vibrations en ciseaux des groupes C–H et aux vibrations d'étirement C–O–H, respectivement39. Enfin, les bandes à 1165, 1040 et 870 cm−1 sont liées à la vibration d'étirement de la liaison C=C des alcènes, de la liaison éther aromatique C–O–C et de la vibration de remue-ménage C–H des composés phénoliques40.

Spectres FT-IR des hydrogels renforcés de fibres (A) PE, (B) CNF/PVA, (C) CNF/PVA/PE1 et (D) CNF/PVA/PE2.

D'autre part, le spectre FT-IR de l'hydrogel CNF / PVA montre une large bande à 3294 cm-1, qui est due à la vibration d'étirement O – H du groupe hydroxyle du PVA et du CNF, comme le montre la figure 5B. Les bandes à 2905, 1708 et 1420 cm−1 appartiennent respectivement à l'étirement C–H, à l'étirement C=O et aux vibrations de flexion CH2. Les autres bandes à 1040 et 870 cm−1 sont liées aux vibrations d'étirement C–O et CH241. Les spectres FT-IR des hydrogels renforcés de fibres CNF/PVA/PE1 et CNF/PVA/PE2 sont présentés sur les figures 5C et D, respectivement. Les spectres des deux échantillons présentent des pics liés à l'hydrogel CNF/PVA, avec quelques modifications. Par exemple, les bandes d'étirement O–H ont été décalées à 3335 et 3351 cm−1 pour les échantillons CNF/PVA/PE1 et CNF/PVA/PE2, respectivement. De plus, les bandes d'étirement C = O ont été observées à 1739 cm-1 pour l'échantillon CNF/PVA/PE1 et à 1725 cm-1 pour l'échantillon CNF/PVA/PE2. Ensemble, ces changements peuvent être attribués à l'interaction entre la matrice polymère CNF/PVA et la propolis41.

La tendance à l'absorption d'eau ou au comportement de gonflement des hydrogels renforcés de fibres CNF/PVA, CNF/PVA/PE1 et CNF/PVA/PE2 est illustrée à la Fig. 6. Les rapports d'absorption d'eau pour tous les échantillons sont élevés et augmentent progressivement avec le temps. Cela peut faire référence à la structure hautement poreuse des échantillons, qui permet à l'eau de se diffuser facilement à travers l'hydrogel. Comme le montre la figure 6, les échantillons chargés de PE (CNF/PVA/PE1 et CNF/PVA/PE2) présentent des taux d'absorption d'eau inférieurs à ceux de pur (CNF/PVA). Par exemple, à un intervalle de temps de 12 h, le rapport d'absorption d'eau pour CNF/PVA est d'environ 907 %, tandis que pour CNF/PVA/PE1 et CNF/PVA/PE2 sont de 648 % et 590 %, respectivement. Par conséquent, la présence de PE dans les hydrogels renforcés de fibres CNF/PVA/PE1 et CNF/PVA/PE2 diminue leur capacité à absorber l'eau, ce qui peut être attribué à la nature hydrophobe du PE et à la diminution de la taille des pores, comme indiqué à partir des observations SEM (Fig. 4)40.

Rapport de teneur en eau (%) des échantillons CNF/PVA, CNF/PVA/PE1 et CNF/PVA/PE2 à différents intervalles de temps.

La propolis est une matière résineuse extraite des bourgeons et des fleurs des plantes et utilisée comme agent protecteur contre la contamination microbienne42. Les polyphénols sont les principaux composants chimiques du PE, et ils sont responsables de son activité antimicrobienne43. L'action antimicrobienne des hydrogels renforcés de fibres PE et CNF/PVA, CNF/PVA/PE1 et CNF/PVA/PE2 a été explorée sur les agents pathogènes pour l'homme en utilisant différentes approches. L'activité antimicrobienne de la PE est présentée dans le tableau 3 et la figure 7. Bien que la PE ait présenté un potentiel antimicrobien contre tous les micro-organismes étudiés, elle n'a aucune influence sur S. typhimurium, comme l'ont rapporté Atik et al.44. L'hydrogel CNF/PVA témoin n'a aucun effet contre les micro-organismes étudiés. Les résultats montrent une activité antimicrobienne significativement plus élevée contre Gram-positif (S. mutans), sans différence significative entre Gram-négatif (E. coli) et C. albicans. De plus, la CMI a également été déterminée par l'étude de l'activité antimicrobienne à différentes concentrations. La CMI de la PE pour E. coli était de 0,012 mg/mL, 0,05 mg/mL pour S. mutans et 0,025 mg/mL pour C. albicans. D'autre part, les hydrogels renforcés de fibres CNF/PVA avec PE à différentes concentrations présentent une action antimicrobienne contre les souches utilisées, l'activité antimicrobienne la plus élevée étant observée chez S. typhimurium, suivi de S. mutans et d'autres microbes ne montrant aucune différence significative. La différence de comportement antimicrobien du PE pourrait être due aux différentes parois cellulaires entre les bactéries Gram-positives et négatives45. L'activité du PE en tant qu'agents antimicrobiens est liée au pourcentage élevé d'hespérétine (183,7 µg/mL), d'acide chlorogénique (96,9 µg/mL) et d'acide caféique (90,2 µg/mL) en tant que principaux composés polyphénoliques du PE. Comme illustré dans le tableau 1, l'hespérétine, l'acide chlorogénique et l'acide caféique ont été signalés comme trois composés de PE avec des concentrations élevées. L'hespérétine a été obtenue à partir de l'hydrolyse enzymatique de l'hespéridine et évaluée pour son activité antimicrobienne contre les bactéries Gram-positives et Gram-négatives, les résultats ont révélé que l'hespérétine inhibait plus efficacement les microbes modèles que l'hespéridine et le glucoside d'hespéridine 46. Yen et al.47. ont constaté que l'acide chlorogénique était l'un des principaux composants de l'extrait aqueux de grains de café vert sous haute pression et a démontré une activité antibactérienne contre les bactéries Gram-positives (Staphylococcus aureus et Listeria innocua) et Gram-négatives (Escherichia coli et Salmonella enterica). L'acide caféique et sa combinaison avec des composés phytochimiques antibiotiques ont été évalués contre Staphylococcus aureus, et les résultats ont montré divers effets contre Staphylococcus aureus, la CMI variant de 256 à 1024 µg/mL48. La plupart des composés polyphénoliques testés n'étaient pas efficaces contre les microbes modèles utilisés lorsqu'ils étaient testés en tant que composé unique, mais lorsqu'ils étaient combinés avec d'autres composés, l'activité des antimicrobiens augmentait. Selon Ahmed et al.49, l'acide gallique à 200 et 400 µg/mL était efficace contre S. aureus et S. pyogenes, mais pas contre les bactéries Gram-négatives. D'autre part, l'antisolvant extrait des eaux usées des moulins à huile combiné à l'acide gallique a été testé à l'aide de faibles concentrations minimales inhibitrices, ce qui a révélé que 50/100–100/100 µg/mL provoquaient une inhibition complète de la croissance de toutes les bactéries utilisées, en raison des effets synergiques des composés phénoliques contre les bactéries modèles utilisées. Une autre étude rapporte que des composés polyphénoliques extraits du marc de raisin combinés à des représentants de différentes classes d'antibiotiques tels que la β-lactame, la quinolone, la fluoroquinolone, la tétracycline et l'amphenicol agissent en synergie dans toutes les souches de S. aureus et E. coli testées avec des valeurs d'indice de concentration inhibitrice fractionnaire (FICI) variant de 0,031 à 0,155. La CMI a été réduite de 4 à 75 fois en raison des effets synergiques des composés phénoliques avec différents antibiotiques50. Des études antérieures ont promu la membrane composite par la propolis pour améliorer leurs bilans biologiques, par exemple acide polylactique/huile essentielle51, poly-ε-caprolactone52, cellulose bactérienne/ZnO-NPs53, chitosan/Ag-NPs54 et polyuréthane/nanolignine55. Nous pouvons résumer les principaux composés polyphénoliques bioactifs du PE comme ayant une activité antimicrobienne dans le tableau 4.

Activité antimicrobienne exprimée sous forme de zones halo du PE à différentes concentrations par la méthode de diffusion de puits d'agar (A) et les hydrogels renforcés de fibres CNF/PVA, CNF/PVA/PE1 et CNF/PVA/PE2 par la méthode de diffusion de disque (B) contre quatre microbes pathogènes.

Les cellules HFB4 ont été incubées avec du PE pendant 24 h à 37 ° C dans du milieu pour développer une feuille monocouche complète. Différentes concentrations de PE ont été appliquées jusqu'à des concentrations de 1000 µg/mL. Nous avons observé que la PE à des concentrations supérieures à 125 µg/mL réduisait significativement la viabilité cellulaire selon le MTT (Fig. 8). Des concentrations allant jusqu'à 125 µg/mL n'ont pas affecté la viabilité cellulaire. De plus, la microscopie optique a été utilisée pour confirmer la prolifération cellulaire lors du traitement des cellules HFB4 avec différentes doses de PE. Une diminution du nombre de cellules lors de l'augmentation de la concentration de PE a été clairement observée par rapport au témoin (Fig. 8). Ces résultats indiquent que des concentrations de PE au-delà de la limite de 125 µg/mL peuvent induire des effets nocifs dans les cellules HFB4. Des études antérieures ont démontré que la supplémentation en extraits naturels peut augmenter la production d'espèces réactives et le stress oxydatif dans les tests in vitro et in vivo, entraînant des dommages oxydatifs et la mort cellulaire73,74.

Viabilité des cellules HFB4 traitées avec différentes concentrations (31,25–1000 μg/mL) de PE pendant 24 h. Les données ont été exprimées en pourcentage moyen de la formation de formazan dans les cellules non traitées (témoin). Les données ont été obtenues à partir de trois expériences indépendantes (six répétitions pour chaque expérience). (*) signifie p inférieur à 0,05 et **p supérieur à 0,05 par rapport au témoin.

La figure 9 montre la viabilité des cellules HFB4 telle que déterminée par le test MTT lorsqu'elles sont traitées avec différents échantillons d'hydrogels. La viabilité des cellules traitées avec des échantillons contenant du PE (CNF/PVA/PE1 et CNF/PVA/PE2) dépasse celle de l'échantillon CNF/PVA sans PE. Cela reflète que la présence de PE améliore la viabilité des cellules HFB4.

(A) Viabilité cellulaire à l'aide du test MTT, tandis que (B – D) micrographies SEM de cellules HFB4 après 24 h ensemencées sur des hydrogels renforcés de fibres CNF/PVA, CNF/PVA/PE1 et CNF/PVA/PE2, respectivement. (*) signifie p inférieur à 0,05 et **p supérieur à 0,05 par rapport au témoin.

Les images SEM de la propagation et de l'adhérence des cellules HFB4 traitées avec des hydrogels renforcés de fibres CNF/PVA, CNF/PVA/PE1 et CNF/PVA/PE2 sont présentées à la Fig. 9. Comme on le voit, toutes les cellules ensemencées ont une forme arrondie, qui peut être causée par la déshydratation pendant le processus de fixation. L'étalement des cellules sur des échantillons chargés en propolis (CNF/PVA/PE1 et CNF/PVA/PE2) est plus élevé par rapport à un échantillon témoin sans PE (CNF/PVA). De plus, la propagation et la fixation des cellules dans l'échantillon avec une teneur plus élevée en PE (CNF/PVA/PE2) sont plus importantes que dans l'échantillon avec une teneur plus faible en PE (CNF/PVA/PE1). Par conséquent, la présence de propolis améliore la croissance et l'adhésion des cellules. Dans l'ensemble, les tests in vitro effectués dans ce travail illustrent l'importance de l'hydrogel renforcé de propolis préparé en tant que matériau cytocompatible favorisant l'adhésion et la propagation cellulaire dans un environnement 3D.

La stabilisation des membranes érythrocytaires est un test établi pour étudier l'effet anti-inflammatoire des biomatériaux implantés. L'inflammation se produit en raison de la libération de différentes enzymes à partir des vésicules lysosomales décomposées75. Par conséquent, la stabilisation de la membrane érythrocytaire empêche la fuite de ces enzymes, ainsi que l'incidence de l'inflammation75. Le test d'hémolyse est un test très critique, en particulier pour les matériaux qui seront en contact avec le sang. Le tableau 5 explique les résultats de l'inhibition de l'hémolyse pour le PE, les échantillons d'hydrogel CNF/PVA et ceux chargés de propolis (CNF/PVA/PE1 et CNF/PVA/PE2). Le médicament indométhacine a été utilisé comme calomnié (témoin positif) et il a la protection la plus élevée (100 ± 2,362 %) à une concentration de 200 µg/mL contre la lyse induite par l'hypotonicité des globules rouges. Comme le montre le tableau 2, tous les échantillons protègent les érythrocytes humains d'une manière dépendante de la concentration. L'effet protecteur de l'échantillon CNF/PVA/PE2 et du PE est presque le même à différentes concentrations. L'effet protecteur le plus faible est enregistré pour l'échantillon CNF/PVA (sans PE). D'après ces découvertes, il est clair que les hydrogels chargés de PE sont prometteurs en tant qu'agents anti-inflammatoires.

La propolis est un sous-produit naturel de grande valeur pour diverses applications biologiques. Les analyses HPLC du PE ont révélé environ 18 composés polyphénoliques, la concentration la plus élevée étant l'hespérétine, suivie de l'acide chlorogénique et de l'acide caféique. Le CNF a été préparé par oxydation-défibrillation de cellulose obtenue à partir de bagasse de canne à sucre blanchie, et utilisé pour préparer du CNF/PVA durable et poreux chargé avec diverses concentrations de PE. Les échafaudages préparés présentaient une structure poreuse élevée avec des tailles de pores allant jusqu'à 100 µm. Les hydrogels CNF/PVA chargés de PE obtenus ont une activité hautement antimicrobienne contre les bactéries E. coli, S. mutans puis C. albicans. Les réponses cellulaires ont également montré que les cellules sur les hydrogels CNF/PVA fonctionnalisés PE ​​ont révélé un microenvironnement optimal pour la fixation et la prolifération des cellules HFB4. Remarquablement, nos résultats suggèrent que la fonctionnalisation PE du CNF/PVA a non seulement amélioré les caractéristiques antimicrobiennes des hydrogels CNF/PVA chargés de PE, mais a également entraîné un potentiel anti-inflammatoire significatif. Ainsi, des expériences in vivo sont fortement recommandées avant l'application clinique pour souligner la puissance des hydrogels CNF/PVA chargés de PE dans la cicatrisation des plaies.

La pâte de bagasse blanchie a été obtenue auprès de Qena Company of Paper Industry, Egypte. TEMPO a été acheté chez Merck. Le bromure de sodium a été acheté chez Sigma-Aldrich. La matière première de propolis utilisée dans ce travail a été collectée auprès d'un apiculteur local (Mansoura, Dakahlia, Égypte) en juillet 2022. L'alcool polyvinylique - PVA (MW85 000–124 000 g/mol, hydrolysé à 99,1 %) a été acheté auprès de Sigma-Aldrich. L'hydroxyde de sodium, l'eau distillée et l'éthanol ont également été utilisés dans cette recherche.

La PE a été collectée selon Bozkuş et al.31 avec peu de modifications. En bref, environ 10 g de matière première ont été dissous dans 100 mL d'éthanol à 70 % puis placés dans un incubateur à 37 °C pendant 14 jours dans un endroit sombre. Après filtration sur papier filtre Whatman (n° 1), le mélange a été centrifugé à 5 000 tr/min pendant 15 min puis séché au four à 40 °C pendant 5 jours jusqu'à poids constant. Le PE obtenu a été conservé au réfrigérateur jusqu'à son utilisation.

Les composés polyphénoliques (phénoliques et flavonoïdes) du PE ont été analysés par HPLC (série Agilent 1260, USA), selon Kong et al., avec de légères modifications76. Conditions chromatographiques : la séparation chromatographique a été réalisée sur une colonne Eclips C18 (4,6 x 250 mm, 5,0 µm). La phase mobile comprenait (A) de l'eau et (B) de l'acide trifluoroacétique à 0,05 % dans de l'acétonitrile à un débit de 1 mL/min. Le gradient de solvant était : 0 min 82 % A, 0–5 min 80 % A, 5–8 min 60 % A, 8–12 min 60 % A, 12–15 min 82 % A, 15–16 min 82 % A et 16–20 min 82 % A. Le détecteur à plusieurs longueurs d'onde a été contrôlé à 280 nm. Le volume d'injection était de 5 ul pour chacune des solutions d'échantillon. La température de la colonne a été maintenue à 40°C.

La bagasse blanchie a été utilisée pour la préparation de CNF oxydé TEMPO en utilisant la méthode décrite par Salama et al.35. En bref, 20 g de pâte de bagasse blanchie ont été dispersés dans de l'eau distillée avec du TEMPO (0,8 g) et du bromure de sodium (8 g). Suite à cela, 300 ml de solution d'hypochlorite de sodium (15 %) ont été ajoutés en continu et le pH a été ajusté à 10 en utilisant une solution de NaOH (3 mol/L). A la fin de la réaction, le pH a été abaissé à 7,0 et le produit a été centrifugé plusieurs fois à 10 000 rpm. Une dialyse utilisant de l'eau déminéralisée a été effectuée pour purifier le produit.

L'hydrogel poreux CNF/PVA a été préparé en utilisant les méthodes de congélation-décongélation et de lyophilisation selon Müller et al.77. Le rapport pondéral polymère a été ajusté à 50:50 (CNF:PVA). En bref, 30 ml de solution de PVA avec une concentration de 10 % en poids ont été préparés dans de l'eau distillée en utilisant une agitation magnétique à 95 °C. Après 4 h, 100 ml de solution de CNF (3% en poids) ont été ajoutés à la solution de PVA et soumis à une agitation mécanique pendant 10 min à 5000 tr/min. Ensuite, le mélange CNF / PVA a été versé dans un moule rond de 10 cm et congelé à - 40 ° C pendant 3 h, suivi d'une décongélation à température ambiante pendant 3 h pour permettre la réticulation du PVA. Les hydrogels obtenus ont été soumis à quatre cycles de congélation-décongélation puis lyophilisés à - 80 °C. Pour produire des hydrogels CNF/PVA chargés de PE, différentes proportions de PE (0,1 et 0,2 g) ont été dissoutes dans 2 ml d'éthanol, puis ajoutées à 22 ml du mélange de solution de suspension CNF/PVA. Les mélanges ont été maintenus sur un agitateur magnétique à 40 ° C pendant 1 h pour assurer une dissolution complète du PE. Les solutions ont été homogénéisées en utilisant une agitation mécanique pendant 10 min à 5000 tr/min avant d'être versées dans un moule rond et soumises à un cycle de congélation-décongélation et enfin lyophilisées à - 80 ° C, comme mentionné ci-dessus. Les échantillons préparés ont été nommés CNF/PVA pour le contrôle (sans PE), CNF/PVA/PE1 pour l'échantillon avec 0,1 g de PE et CNF/PVA/PE2 pour l'échantillon avec 0,2 g de PE.

La morphologie de l'hydrogel CNF/PVA préparé renforcé avec différentes concentrations de PE a été examinée à l'aide de la microscopie électronique à balayage à émission de champ (FE-SEM) (JSM 6360LV, JEOL/Noran). L'estimation de la taille des pores a été déterminée à partir de différentes images SEM à l'aide de l'outil d'angle d'ImageJ avec le logiciel Java 1.8.0 (National Institute of Health (NIH), USA)78. Le FT-IR (modèle FT/IR-6100 type A) a été utilisé pour étudier les groupes fonctionnels chimiques des échantillons. Les spectres ont été enregistrés à des nombres d'onde compris entre 400 et 4000 cm-1. Le diagramme XRD a été enregistré avec un diffractomètre à poudre empyrée (Cu Kα, 0,154 nm) entre 5 et 70° 2θ avec un pas de 0,01°/s pour examiner la phase formée dans le CNF préparé. Le microscope électronique à transmission ultra haute résolution (JEOL-2010) a été appliqué pour examiner la structure interne du CNF.

L'évaluation de l'hydrogel préparé pour l'absorption d'eau a été réalisée selon Eskandarinia et al.79 avec de légères modifications. Les hydrogels renforcés de fibres préparés (CNF/PVA, CNF/PVA/PE1 et CNF/PVA/PE2) ont été coupés en 1 cm × 1 cm, pesés avec précision (Wi) et immergés dans 10 ml d'eau distillée dans des flacons scellés à 37 oC. À des intervalles de temps programmés (1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 et 12 h), des échantillons ont été prélevés des flacons, épongés avec un papier de soie pour éliminer l'eau de surface et pesés (Ww). Le taux d'absorption d'eau (gonflement) des échantillons est spécifié selon l'équation suivante :

L'activité antimicrobienne des hydrogels renforcés de fibres PE, CNF/PVA, CNF/PVA/PE1 et CNF/PVA/PE2 a été évaluée contre quatre agents pathogènes sélectionnés, y compris les bactéries Gram-négatives [Escherichia coli ATCC 25922 (E. coli) et Salmonella typhimurium ATCC 14028 (S. typhimurium)], les bactéries Gram-positives [Streptococcus mutans ATCC 25175 (S. muta ns)], et la levure [Candida albicans ATCC 10231 (C. albicans)]. Tous les microbes ont été fournis par l'American Type Culture Collection (ATCC). Les souches microbiennes ont été cultivées dans un tube à essai contenant 5 ml de bouillon Mueller Hinton composé de (%) : 0,2 extrait de bœuf, 1,75 hydrolysat acide de caséine et 0,15 amidon, sous culture fixe (200 tpm) pendant 1 jour à 37 °C. L'activité antimicrobienne de la propolis et de différents échantillons d'hydrogel a été réalisée par l'approche de diffusion de puits d'agar et de disque, respectivement.

L'action antimicrobienne du PE a été évaluée qualitativement par la technique de diffusion en puits d'agar selon Roy et Rhim80, avec peu de modifications. En peu de temps, la suspension microbienne (108 UFC/mL) avec une concentration ou une densité approximativement égale à 0,5 étalon McFarland a été étalée sur la surface de la boîte de Pétri contenant du milieu de gélose Mueller Hinton (2 %). La concentration minimale inhibitrice (CMI) est la concentration minimale de PE qui présente une faible zone d'inhibition contre la cible microbienne. Pour la détermination de la CMI, la propolis à différentes concentrations de 0,1, 0,05, 0,025, 0,012 et 0,006 mg/mL (étiquetées respectivement 1, 2, 3, 4 et 5) a été creusée dans les puits de média (4 mm de diamètre) par un foreur vitreux stérile et chargé avec 65 μL de propolis testée. Le contrôle négatif a été réalisé en chargeant les puits centraux avec du DMSO.

L'activité antimicrobienne des hydrogels renforcés de fibres CNF/PVA, CNF/PVA/PE1 et CNF/PVA/PE2 préparés a été réalisée par l'approche de diffusion de disque selon Yahia et al.81, avec des modifications mineures. En bref, 100 µL d'agents pathogènes dilués en série ont été distribués séparément sur les boîtes de Pétri de milieu de gélose Mueller Hinton avec des disques (5 mm de diamètre) des membranes composites chargées de différentes concentrations de propolis. L'hydrogel renforcé de fibres sans propolis a été utilisé comme témoin.

Toutes les plaques ont été laissées à 4°C pendant 120 min. pour compléter la diffusion de l'échantillon testé ainsi que pour inhiber les microbes modèles, ensuite incubés à 37 ° C pendant 1 jour, où l'activité antibactérienne a été évaluée en mesurant le diamètre de la zone d'inhibition développée (y compris le puits ou le disque membranaire) après la période d'incubation. Pour assurer les conditions aseptiques, toutes les membranes ont été stérilisées pendant 30 min sous lumière UV avant l'application. Toutes les expériences ont été menées en triple, et les résultats moyens ont été représentés.

Le test de cytotoxicité des hydrogels renforcés de fibres CNF / PVA, CNF / PVA / PE1 et CNF / PVA / PE2 ainsi que du PE contre les cellules HFB4 a été effectué à l'aide du test MTT (3-4,5-diméthyl-2-thiazolyl) -2,5-diphényl-2H-tétrazolium bromure). Les hydrogels préparés ont été rincés trois fois avec le milieu, puis étalés au fond d'une plaque de culture tissulaire à 24 puits. La plaque à 24 puits a été inoculée avec 1 × 105 cellules/mL (1000 µL/puits) et incubée à 37 °C pendant 24 h pour développer une feuille monocouche complète. Les cellules ont été observées pour la formation de feuillets et les effets de cytotoxicité. Les cellules HFB4 ont été vérifiées pour tout signe physique de toxicité, par exemple, perte complète ou partielle de la monocouche, arrondi, rétrécissement ou granulation cellulaire. Une solution de MTT a été préparée (5 mg/mL dans du PBS) (BioBasic Canada Inc). 100 µL de solution MTT ont été ajoutés à chaque puits. Mettre sur une table à secousses, 150 tr/min pendant 5 min, pour bien mélanger le MTT dans les médias. Incuber (37 oC, 5 % CO2) pendant 4 h pour permettre au MTT d'être métabolisé. Après cela, 200 μL de DMSO ont été mélangés aux cellules de culture pour solubiliser les cristaux de formazan, qui ont été obtenus via la réduction du MTT dans les cellules vivantes. Ensuite, l'absorbance moyenne de chaque puits à 570 nm a été calculée à l'aide d'un spectrophotomètre. Trois expériences parallèles ont été réalisées. L'absorbance doit être directement corrélée à la quantité de cellules82,83. Pour la PE, la plaque de culture tissulaire à 24 puits a été inoculée avec 1 × 105 cellules/mL (100 µL/puits) et incubée à 37 °C pendant 24 h pour développer une feuille monocouche complète. Le milieu de croissance a été décanté des plaques de microtitration à 24 puits après la formation d'une feuille confluente de cellules. Ensuite, la monocouche cellulaire a été lavée deux fois avec un milieu de lavage. Une dilution au 1/2 de l'échantillon testé a été réalisée dans du milieu RPMI avec 2% de sérum (milieu d'entretien). 0,1 ml de chaque dilution a été testé dans différents puits, laissant 3 puits comme témoins, ne recevant que du milieu de maintenance. Ensuite, les mêmes étapes ont été effectuées comme mentionné ci-dessus.

Les cellules HFB4 ont été cultivées dans des plaques à 24 puits contenant des hydrogels renforcés de fibres CNF/PVA, CNF/PVA/PE1 et CNF/PVA/PE284. Après 24 h d'incubation, les cellules ont été fixées avec du glutaraldéhyde à 5 % (V/V), puis déshydratées progressivement avec des solutions en série d'éthanol (70 à 100 % pendant 20 min chacune). Après cela, les échantillons ont pulvérisé de l'or pour les observations SEM.

La préparation de la suspension d'érythrocytes a été effectuée selon Anosike et al.75. En bref, environ 3 ml de sang total frais prélevé sur des volontaires sains ont été placés dans des tubes héparinés puis centrifugés à 3000 rpm pendant 10 min. Un volume de solution saline normale égal à celui du surnageant a été utilisé pour dissoudre les culots de sang rouge. Le volume des culots de sang rouge dissous obtenus a été mesuré et renvoyé sous la forme d'une suspension à 40 % v/v avec une solution tampon isotonique (tampon phosphate de sodium 10 mM, pH 7,4). La solution tampon a été formée à partir de 0,2 g de NaH2PO4, 1,15 g de Na2HPO4 et 9 g de NaCl dans 1 L d'eau distillée. Les globules rouges retournés (surnageant remis en suspension) ont été utilisés tels quels.

Des poids égaux d'hydrogels renforcés de fibres CNF/PVA, CNF/PVA/PE1 et CNF/PVA/PE2 ont été soigneusement broyés et mis en suspension dans de l'eau distillée (solution hypotonique). 5 mL de la solution hypotonique de doses graduées des échantillons (100, 200, 400, 600, 800 et 1000 µg/mL) ont été placés dans des paires en double (par dose) de tubes à centrifuger. 5 ml de solution isotonique de doses graduées des échantillons (100 à 1000 µg/mL) ont également été placés dans des paires en double (par dose) de tubes à centrifuger. Les mêmes étapes précédentes ont eu lieu pour la résine PE, mais sans broyage. Un tube contenant 5 mL du véhicule (eau distillée) et un autre tube contenant 5 mL de 200 µg/mL d'indométhacine ont été utilisés comme tubes témoins, respectivement. Une suspension (0,1 ml) d'érythrocytes a été ajoutée à chacun des tubes et mélangée doucement. Les mélanges ont été incubés pendant 1 h à température ambiante (37°C), puis ils ont été centrifugés pendant 3 min à 1300 tr/min. L'absorbance (Ab) de l'hémoglobine dans le surnageant a été estimée à 540 nm en utilisant un spectrophotomètre Spectronic (Milton Roy). Pour calculer le pourcentage d'hémolyse, on a supposé que l'hémolyse formée en présence d'eau distillée était de 100 %. Le pourcentage d'inhibition de l'hémolyse par l'extrait a été calculé ainsi :

où Ab1 = absorbance de l'échantillon à tester dans une solution isotonique, Ab2 = absorbance de l'échantillon à tester dans une solution hypotonique, Ab3 = absorbance de l'échantillon de contrôle dans une solution hypotonique75,85.

Toutes les expériences ont été réalisées en triple exemplaire et les résultats ont été présentés sous forme de moyenne ± écart type. Les analyses statistiques ont été effectuées avec le test ANOVA unidirectionnel, en utilisant le logiciel Sigma Stat 3.5 (Dundas Software Ltd, Toronto; Canada). Les valeurs P ≤ 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives.

Les ensembles de données utilisés et/ou analysés au cours de la présente étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Département de physique, Faculté des sciences, Université Al-Azhar, (Branche des filles), PO Box 11884, Le Caire, Égypte

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Cellulose and Paper Department, National Research Centre, 33 El-Bohouth St., Dokki, PO 12622, Gizeh, Égypte

Ahmed Salama et Ahmed K. Saleh

Département des polymères et des pigments, Centre national de recherche, 33 rue El-Bohouth, Dokki, PO 12622, Gizeh, Égypte

Bothaina Abd Elhady & Emad Tolba

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SS, AMA : méthodologie, enquête, analyse formelle, rédaction du projet original. A.Salama, A.Saleh, ET : conceptualisation, méthodologie, enquête, analyse formelle, rédaction—révision et édition. BAE : enquête, analyse formelle, rédaction-révision et édition.

Correspondance à Ahmed K. Saleh.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Saleh, S., Salama, A., Ali, AM et al. Extrait de propolis égyptienne pour la fonctionnalisation de l'hydrogel poreux de nanofibres de cellulose/poly(alcool vinylique) ainsi que la caractérisation et les applications biologiques. Sci Rep 13, 7739 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34901-6

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Reçu : 07 décembre 2022

Accepté : 09 mai 2023

Publié: 12 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-34901-6

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